薩拉米香腸發酵成熟過程中蛋白質水解及脂質氧化規律

韋友兵，吳 香，周 輝，李新福，李 聰，徐寶才*

（1.江蘇雨潤肉食品有限公司，江蘇 南京 211806；2.肉品加工與質量控制國家重點實驗室，江蘇 南京 211806；3.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230000；4.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230036）

薩拉米香腸是以豬、牛肉為原料，利用微生物或組織內源酶發酵生產的具有特殊風味、色澤和質地及較長保質期的肉制品[1-2]。薩拉米香腸在發酵成熟過程中，會發生一系列的生化反應，從而產生不同的風味物質。這類反應主要是蛋白質和脂肪的分解氧化，一部分靠原料肉內部的酶催化完成，另一部分則與其中的微生物密切相關[3]。另外，在蛋白質及脂質發生水解過程中，還會發生一系列的氧化還原反應，例如氨基酸脫氨脫羧、脂肪酸脫水氧化等，這些均能促進發酵肉制品的風味形成[4]。發酵肉制品中大多數的風味物質均產生于發酵成熟階段，可以通過添加不同的酶制劑或腌制劑豐富產品的風味品質[5]。在薩拉米香腸的發酵成熟過程中，肌肉內的脂質在微生物[6-9]及脂質水解酶的作用下，可以產生大量的游離脂肪酸；另外，這些脂肪酸中的部分不飽和脂肪酸在微生物和脂肪氧合酶的作用下，被氧化為小分子芳香類物質，是構成產品風味的重要組成部分[10-13]。但是，過度的脂質氧化也是發酵肉制品酸敗、褐變的重要原因，極大降低肉制品的品質。脂質氧化的主要原料為不飽和脂肪酸，其初級代謝產物對產品的風味無明顯的貢獻作用，而其二級氧化產物可以產生大量的烷烴、醇類、碳酸類小分子風味及滋味物質[14]。脂肪酸經過β-氧化后可以產生酮類物質，也會對產品風味起到積極作用。脂肪酸氧化產物也可以與脂肪酸一起發生縮合反應產生令人愉悅的酯類成分。典型的意大利發酵香腸中即含有大量的酯類風味成分，我國發酵肉制品中也含有大量的酯香類物質[15]。

本實驗以薩拉米香腸為研究對象，針對其發酵過程中主要發酵菌種變化對產品蛋白質、脂肪等水解和氧化程度的影響，探尋薩拉米香腸發酵成熟過程中蛋白質水解規律和脂質氧化規律，可以為薩拉米香腸的生產加工提供技術指導，提供科學完整的質量品質評價體系，對于改善薩拉米香腸的質量品質以進一步滿足消費者需求有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍豬肉、香辛料、食鹽、葡萄糖、D-異抗壞血酸鈉、硝酸鉀、亞硝酸鈉（均為食品級） 江蘇雨潤肉食品有限公司；SM-181型號菌種發酵劑（包括清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）（＞2.9×109CFU/g）） 科漢森（中國）有限公司；C6～C20烷烴標準品 美國AccuStandard Inc公司；二硫蘇糖醇、乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸、檸檬酸三鈉、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氯仿、甲醇、異丙醇、冰乙酸、乙醚、硫酸銅、氫氧化鈉、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍、巰基乙醇、過硫酸胺碳酸鈉、鹽酸、NaOH、甘氨酸、Na2HPO4、KH2PO4、氯化鉀、甲醛溶液均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

UV-2600紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；Allegra-64R臺式冷凍離心機 美國Beckman公司；NHWY-200B臺式全溫度恒溫搖床 常州諾基儀器有限公司；2300型KjeltecTM自動凱氏定氮儀 丹麥Foss分析儀器公司；602S穩壓穩流電泳儀 北京六一儀器廠；FR-980生物電泳圖象分析系統 上海復日科技有限公司；Trace MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國Finnigan公司；DB-5毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm）美國J&W Scientific公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器有限公司；DC-12H型氮吹儀 上海安譜科學儀器有限公司；氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 薩拉米香腸加工流程及取樣

薩拉米香腸加工工藝：原料肉→解凍→預斬→絞制→撒料（發酵劑接種）→打散→攪拌→灌裝→發酵成熟→剝皮包裝。

其中：原料肉剔除筋膜等雜質后，采用低溫解凍，解凍室溫度在0～4 ℃，待中心溫度達到-2.5～-1.5 ℃時解凍結束；將解凍好的原料肉投入斬拌鍋斬拌，刀和鍋采用低速斬拌待肉塊變小易于絞肉后，即可將肉餡送入絞肉機中，斬拌后肉溫不得超過0 ℃；將混合后的輔料（含菌種發酵劑）均勻撒在傳送帶上的肉餡表面，經過打散機打散，使肉餡和輔料混合均勻；待顏色均一，肉餡相互之間有黏連即可停止攪拌，出機待灌裝；采用不可食膠原蛋白腸衣灌裝，灌裝后的腸體應飽滿緊繃，無肉眼可見氣泡。具體發酵成熟工藝及取樣點見表1。不同取樣樣品剝皮包裝操作包裝貯藏、備用，以原料肉為對照。

表1 發酵工藝及取樣點Table 1 Fermentation and ripening process and sampling points

1.3.2 薩拉米香腸蛋白質水解變化規律測定

游離氨基酸測定：參考趙見營等[16]的方法采用氨基酸自動分析儀測定樣品中的游離氨基酸組成及含量，以干基計。

蛋白質水解指數的測定[17]：蛋白質水解指數/%=非蛋白氮/蛋白氮×100。其中，非蛋白氮及蛋白氮含量均采用全自動凱氏定氮儀測定。

蛋白組分分離[18]：取干燥后肉樣20.0 g，加入100 mL溶液A（3.5 mmol/L KH2PO4、15.6 mmol/L Na2HPO4，pH 7.5），勻漿1 min后于8 000 r/min條件下冷凍離心15 min，重復操作2 次，分離上清液和沉淀；在上清液加入適量TCA，使TCA質量分數為10%，8 000 r/min冷凍離心15 min，上清液為非蛋白氮，收集沉淀即為肌漿蛋白；沉淀部分加入100 mL的溶液B（15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4、0.45 mol/L KCl，pH 7.5）并勻漿1 min，8 000 r/min冷凍離心15 min，此提取過程重復操作2 次，合并上清液即為肌原纖維蛋白，沉淀部分為總基質蛋白。向總基質蛋白中添加50 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液，攪拌8 h，8 000 r/min冷凍離心15 min，上清液為堿溶蛋白，沉淀部分為堿不溶蛋白。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析：利用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度[19]并進行SDS-PAGE分析。其中，分離膠為10%，濃縮膠為5%，用考馬斯亮藍G-250染色。

1.3.3 薩拉米香腸脂質氧化作用測定

通過薩拉米香腸發酵過程中過氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值判斷脂質氧化規律，通過提取脂肪分析在薩拉米香腸發酵成熟過程中中性脂質、磷脂、游離脂肪酸的相對含量變化，并采用氣相色譜分析儀分析游離脂肪酸組成的相對含量變化，以此確定薩拉米香腸發酵成熟過程中脂質水解規律。

1.3.3.1 脂質氧化測定

POV測定：參照GB/T 5009.37—2003《動植物油脂過氧化值的測定》。

TBARS值的測定[20]：稱取5.0 g樣品于80 mL離心管中，加25 mL 20% TCA溶液和20 mL H2O，勻漿靜置1 h并在2 000×g冷凍離心10 min，過濾并收集濾液，濾液定容到50 mL。取2 mL濾液加2 mL TBA溶液（0.02 mol/L），在沸水浴中充分反應20 min，冷卻后用UV-2600紫外-可見分光光度計測定其在532 nm波長處吸光度；空白樣：25 mL 20% TCA溶液用雙蒸水定容到50 mL，然后取2 mL濾液加2 mL TBA。TBARS值由標準曲線計算，結果以每千克樣品中丙二醛質量表示（mg/kg）。

1.3.3.2 總脂肪的提取[21]

取20.0 g樣品切碎，稱取2.00 g于離心管加入25 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液，勻漿60 s轉移到帶塞量筒中定容至40 mL，靜置30 min后過濾，除去其中的蛋白、結締組織，加入0.22 倍體積的鹽水，靜置2 h分層或3 000 r/min離心15 min，吸凈上層液體（水、甲醇、離子雜質等），將剩余液體轉移至平底燒瓶中，用旋轉蒸發器在40 ℃水浴條件蒸干溶劑，殘留物于-20 ℃貯存備用。

1.3.3.3 脂質分離[22]

稱量30～60 mg脂肪，溶解于5 mL的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液中，然后吸取全部液體用100 mg的氨丙基硅柱（VARIAN）分離，首先用5 mL的氯仿-異丙醇（2∶1，V/V）溶液洗出中性脂質，再用5 mL乙醚-乙醇（2∶1，V/V）溶液沖洗出游離脂肪酸，最后一步用5 mL的甲醇-鹽酸（9∶1，V/V）溶液洗出磷脂。洗脫過程中分別用干燥并稱質量過10 mL離心管收集各部分脂質，用氮氣儀吹干其中的溶劑，然后再分別稱量，計算各部分脂質占總脂肪的百分含量。

1.3.3.4 游離脂肪酸的測定及氣相色譜分析

游離脂肪酸的甲酯化：在提取的1 mg脂肪酸中加入2 mL質量分數10%的三氟化硼-甲醇溶液，加入少量2,2-二甲氧基丙烷作為除水劑，60 ℃水浴30 min。充分冷卻后添加1 mL蒸餾水和1 mL正庚烷振蕩1 min，靜置分層后吸取全部上層有機層，加入十七酸甲酯作為內標物，用氮吹吹干溶劑，用正庚烷定容，以備色譜測定。

氣相色譜條件：DB-23色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：90 ℃，保持2 min，10 ℃/min升至180 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min速率升到240 ℃，保持12 min；載氣流速1 mL/s；進樣量1 μL，分流比1∶70；進樣口溫度240 ℃；火焰離子監測器檢測溫度240 ℃。

1.4 數據處理

采用SPSS 20.0軟件處理數據并分析作圖，平均值用Duncan多重比較進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）（n=3）。

2 結果與分析

2.1 蛋白質水解變化規律

2.1.1 蛋白質水解指數變化

圖1 薩拉米香腸發酵成熟過程中蛋白質水解指數變化Fig. 1 Changes in proteolysis index during processing of salami

從圖1可以看出，隨著發酵成熟時間的延長，原料中蛋白質水解指數顯著增加（P＜0.05）。另外，薩拉米香腸在高溫發酵階段蛋白質水解指數顯著增加，從10.3%增加至17.7%，是其蛋白質水解的主要階段，這主要是因為高溫發酵階段微生物的大量生長和該溫度條件下組織蛋白酶有更高的活力。在薩拉米香腸的發酵成熟過程中，由于微生物及內源蛋白酶的作用，部分蛋白質不斷被水解為肽類、游離氨基酸等風味、滋味物質及其前體物質，構成發酵肉制品的風味體系。隨著發酵時間的延長，蛋白質水解指數的增加趨勢逐漸降低，這是由于在發酵后期，微生物代謝和pH值處于穩定狀態，可有效維持蛋白質的水解速率。

2.1.2 蛋白質組分變化

表2 薩拉米香腸發酵成熟過程中蛋白質組分比較Table 2 Comparison of protein components during processing of salami

從表2可以看出，肌漿蛋白氮和肌原纖維蛋白氮相對含量在發酵成熟過程中不斷降低；其中肌漿蛋白氮從21.22%降低至11.35%，高溫發酵成熟階段是薩拉米香腸肌漿蛋白分解的主要時期；對于肌原纖維蛋白氮，在發酵成熟過程中從19.50%降低8.77%，對薩拉米香腸的風味形成有重要的貢獻。肌漿蛋白氮和肌原纖維蛋白氮降低主要是因為在微生物及組織蛋白酶的作用下，不斷分解為小分子非蛋白類物質，另外內源性蛋白酶在蛋白質降解過程中比微生物分泌的蛋白酶發揮的作用更大，特別是在加工過程的初期，這與Sanz等[23]的研究結果一致。本實驗發酵菌種中含有清酒乳桿菌，其對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解有潛在的作用[24]。另外，在薩拉米香腸發酵后期，堿溶蛋白氮增加較顯著，堿不溶蛋白氮相對含量無顯著變化（P＞0.05）。這是由于發酵成熟條件，導致蛋白質發生變性，逐漸變為堿溶蛋白質，非蛋白氮相對含量及堿溶蛋白氮相對含量的增加也證明了這一點。

2.1.3 不同蛋白質組分電泳結果

根據2.1.2節結果，薩拉米香腸不同蛋白質組分在發酵成熟過程中，肌漿蛋白質和肌原纖維蛋白質不斷水解，如圖2所示，2 種蛋白質在泳道1和2之間條帶無明顯的差異，即在脫水階段蛋白質無明顯的分解。對于肌漿蛋白質（圖2b），在泳道3～6中，100～120 kDa的條帶逐漸變模糊，同理20～25、80～85 kDa附近的條帶清晰度也逐漸降低，說明在發酵成熟過程中肌漿蛋白質不斷分解；同時，從圖2b可以看出，60 kDa以及15 kDa附近的條帶逐漸變亮，說明小分子質量的肌漿蛋白質不斷累積。從圖2a也可以看出，肌原纖維蛋白在發酵成熟過程中也不斷分解，表現為120～200 kDa的條帶在發酵30 d（泳道5）后條帶變細，并且40～50 kDa附近的條帶隨著發酵時間的延長逐漸變少，說明肌原纖維蛋白和肌漿蛋白在微生物的作用下會生成親水性的多肽，在發酵成熟中不斷分解。

2.1.4 游離氨基酸組成變化

游離氨基酸的釋放及分解是發酵肉制品風味及滋味形成的重要來源，主要來源于大分子質量蛋白質及肽類的水解，在薩拉米香腸的發酵成熟過程中蛋白質不斷水解，見表3。隨著發酵成熟時間的延長，產品中的游離氨基酸總量呈顯著的先升高后降低的趨勢，尤其是在高溫發酵成熟及發酵15 d過程中，產品中大量的游離氨基酸釋放并累積，主要是因為微生物對蛋白質的作用，在肽酶的作用下使蛋白質分解產生多肽和各種氨基酸[25-26]；隨著發酵時間的延長至發酵45 d成熟階段，產品中的游離氨基酸總量逐漸降低至1 307.64 mg/100 g，并且除色氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、脯氨酸外，其他游離氨基酸在此過程中呈先增加后降低的趨勢。說明在薩拉米香腸的發酵成熟過程中，大分子蛋白質及肽類水解釋放的氨基酸進一步發生反應，產生其他小分子物質。這些氨基酸可能是由蛋白水解作用產生的，他們在后期成熟過程中占主導，這對薩拉米香腸發酵風味的形成有一定的貢獻[27]。其中，谷氨酰胺代謝產生的谷氨酸在發酵后期大量積累，它能夠產生鮮味；綜合上述分析可以看出，在薩拉米香腸的發酵成熟過程中，蛋白質水解指數不斷增加，表現為肌漿蛋白質和肌原纖維蛋白質相對含量逐漸降低，并且在高溫發酵成熟及發酵15 d的成熟階段是蛋白質水解和游離氨基酸總量累計的主要階段。另外，隨著薩拉米香腸進入發酵階段時，蛋白質水解指數變化逐漸升高，并且游離氨基酸總量也相應升高。

表3 薩拉米香腸發酵成熟過程中游離氨基酸變化Table 3 Changes in free amino acids during processing of salami mg/100 g

2.2 脂質氧化作用

2.2.1 脂質組成變化

表4 薩拉米香腸發酵成熟過程中脂質相對含量組成Table 4 Change in lipid composition during processing of salami%

在薩拉米香腸發酵成熟過程中，由于微生物及脂肪水解酶的分解作用，產品中的脂質組成也會不斷發生變化。從表4可以看出，產品中的中性脂質及游離氨基酸的相對含量不斷增加，而磷脂的相對含量不斷降低。在發酵成熟后期，產品中的3 種脂質成分變化趨勢逐漸減少。結果表明，在薩拉米香腸發酵成熟過中，在微生物以及中性脂酶、酸性脂酶、磷脂酶等內源酶的作用下，脂質不斷水解，將多肽降解生成游離脂肪酸，導致游離脂肪酸相對含量不斷增加。這可能是乳酸菌作用形成風味的主要途徑[28]。本實驗采用的一種發酵菌種為木糖葡萄球菌，有研究顯示葡萄球菌具有較強的分解脂肪能力[29]，對發酵香腸獨特風味的形成發揮了重要作用，成為香腸的“風味菌”，這也說明了木糖葡萄球菌對薩拉米香腸發酵過程風味的形成具有重要作用。

2.2.2 游離脂肪酸組成變化

表5 薩拉米香腸發酵成熟過程中游離脂肪酸組成Table 5 Change in free fatty acids composition during processing of salami mg/kg

在發酵肉制品中的游離脂肪酸主要包含了飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA），是構成產品滋味和形成產品風味的重要原料。從表5可以看出，隨著發酵成熟過程的進行，SFA和MUFA均呈顯著增加趨勢，PUFA呈現上升后下降的趨勢。對于飽和脂肪酸，除二十碳酸外，其余飽和脂肪酸在發酵過程中的含量不斷增加；對于不飽和脂肪酸，除油酸和鱈油酸外，其他不飽和脂肪酸的含量均呈現先升高后降低的過程。主要是因為在發酵成熟前期，產品中的脂質不斷水解；隨著發酵成熟過程的進行，大量不飽和脂肪酸發生氧化生成脂質羰基化合物，同時產生醇類、醛類和酮類等化合物，能通過自由基鏈反應形成過氧化物，這些次級反應產生大量揮發性化合物，從而導致不飽和脂肪酸的含量不斷降低。

2.2.3 脂質氧化變化

薩拉米香腸發酵成熟過程中，在脂肪氧合酶及活性自由基的作用條件下，大量的不飽和脂肪酸被氧化成其他小分子烴類、醛類、醇類及酮酸類等成分，是形成產品風味和滋味的重要物質。從圖3可以看出，產品POV及TBARS值均呈顯著先增加后降低的趨勢（P＜0.05）。可能是在發酵前期，乳酸菌快速生長繁殖，消耗氧產生大量乳酸[30]，形成缺氧的低酸環境，降低了脂肪酸氧化反應速度；發酵前中期，隨著pH值的緩慢回升和亞硝酸鈉的減少，脂肪氧化速度增加；在發酵后期，可能由于pH值回升和微生物分布的改變，脂肪氧化產生的醛類物質發生了其他的化學反應，從而導致TBARS值的下降[31]。但不同的是，POV最高點出現在發酵成熟的15 d時，而TBARS最高值出現在發酵30 d時；隨著發酵時間的繼續延長，產品POV及TBARS值均有顯著（P＜0.05）降低趨勢。在發酵成熟結束后，產品POV和TBARS值分別為0.083 2%和0.38 mg/kg。

圖3 薩拉米香腸發酵成熟過程中脂質氧化變化Fig. 3 Changes in lipid oxidation during processing of salami

綜上分析可以看出，在薩拉米香腸發酵成熟過程中，中性脂質及游離脂肪酸相對含量顯著增加，而磷脂相對含量不斷降低；在不飽和脂肪酸中，除油酸和鱈油酸外，其余脂肪酸在發酵成熟過程中均呈現先升高后降低的趨勢，并且該趨勢與POV及TBARS值的變化趨勢相同。

3 結 論

在薩拉米香腸的發酵成熟過程中，高溫發酵成熟及發酵15 d的成熟階段是蛋白質水解和游離氨基酸總量累計的主要階段，這主要是因為高溫發酵階段微生物的大量生長和該溫度條件下組織蛋白酶有更高的活力。另外，隨著發酵成熟進入發酵第45天時，游離氨基酸總量略降低但與發酵中期總量差異性不顯著。中性脂質及游離脂肪酸相對含量顯著增加（P＜0.05），而磷脂相對含量不斷降低；在不飽和脂肪酸中，除油酸和鱈油酸外，其余脂肪酸在發酵成熟過程中均呈現先升高后降低的趨勢，并且該趨勢與脂質氧化（POV、TBARS值）的變化趨勢相同。因此，薩拉米香腸發酵成熟過程中脂質水解及氧化的發生是同步的。其中，在薩拉米香腸發酵過程中，清酒乳桿菌對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解有潛在的作用，木糖葡萄球菌具有較強的分解脂肪能力，對發酵香腸獨特風味的形成發揮了重要作用，成為香腸的“風味菌”。