新型產瓊膠酶海洋細菌Arthrobacter sp. ZXY772的分離鑒定及其應用

陳彥梅 聶語琪 謝燕純 鄧素奇 張揚 周欽茂 陳瓊華

摘要? ? 從廣東省南澳島采集龍須菜（Gracilaria lemaneiformis），分離出一株酶活性較高的瓊膠酶產生菌，探究其應用價值，通過篩選培養基分離產瓊膠酶的菌株，采用形態學和16S rRNA基因序列分析對菌株進行初步鑒定，構建系統發育樹;采用DNS比色法對瓊膠酶活性進行測定;初步探究菌株所產瓊膠酶類型和酶解產物的抑菌效果。結果表明，經分離純化得到一株產瓊膠酶海洋細菌ZXY772，該菌株為革蘭氏陽性球桿菌，屬于節桿菌屬（Arthrobacter sp.）;胞外酶只產β-瓊膠酶;該菌株于28 ℃、轉速為180 r/min液體發酵培養基中振蕩培養時，其生長對數期為3～14 h，當菌株搖床發酵至27 h，其瓊膠酶活力到達最高96.0 U/mL;菌株粗酶液的酶解產物對枯草芽孢桿菌的抑制效果最強，其抑菌圈直徑大小到達14.45 mm。

關鍵詞? ? 瓊膠酶;節桿菌屬;鑒定;抑菌

中圖分類號? ? Q936? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）17-0237-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? A agarase-producing strain was isolated and identified from Gracilaria lemaneiformis collected from Nan′ao Island，Guangdong Province to study its wide application values. The agarase-producing strains were isolated by different screening culture-mediums，and identified by morphology and the analyses of 16S rRNA sequence to construct a phylogenetic tree. The agarase activity was determined by DNS colorimetry. Agarase type produced by the strains and the bacteriostatic effect of enzymatic hydrolysate were investigated.The results showed that after isolation and purification，a strain of agarase-producing ZXY772 was obtained. The strain was Gram-positive，coccus，belonging to Arthrobacter sp.，producing extracellular β-agarase.The strain was cultured in a liquid fermentation medium under the condition of 180 r/min and 28 ℃，the logarithmic phase of the strain was 3-14 h and the agarase activity of ZXY772 reached 96.0 U/mL after fermenting for 27 h.The enzymatic hydrolysate of the crude enzyme solution had the most obvious bacteriostasis to Bacillus subtilis，and the diameter of the inhibition zone reached 14.45 mm.

Key words? ? agarase;Arthrobacter sp.;identification;bacteriostasis

瓊膠（agar）是一種海洋多糖，普遍存在于石花菜、龍須菜等多種藻類植物及部分寄生在軟體動物的海洋細菌當中。目前，工業大量生產瓊膠的首要來源是海藻。

我國海域具有豐富的海藻資源，其中數千種海藻中有一百多種被認為有經濟價值。近年來，我國在海藻養殖方面取得了很大進展，但在開發利用方面還比較薄弱，存在很大的資源利用空間。利用海藻生產出來的瓊脂，水解成瓊膠低聚糖即瓊膠寡糖，具有多種生理活性，如抗癌、抗氧化、抗病毒、抗血栓等[1]，在食品、化工、醫藥、美妝方面[2]有重大的利用價值。當前利用瓊膠獲取瓊膠寡糖的方法主要有生物酶法和化學法。其中，化學法處理有較多不足和局限，如較難精確控制水解度，后期的分離純化過程十分復雜，不容易操作，而且利用該法生成的瓊膠寡糖生物活性很低并容易喪失;而生物酶法作用環境十分溫和，降解過程易控制，產物專一且易于分離純化，工藝環保高效[3]。因此，為解決海藻深加工及瓊膠寡糖開發利用所面臨的瓶頸問題，新型高產瓊膠酶菌株的開發及應用基礎研究勢在必行，這也是本試驗研究的意義所在。

瓊膠酶主要通過藻類生物和海洋微生物獲得，其中海洋微生物來源居多。因此，獲得高產瓊膠酶菌株是開發微生物瓊膠酶的前提條件。迄今，人們對瓊膠酶產生菌的探究已經逐漸深入，現已從海洋藻類、海洋軟體動物及淤泥中分離得到多株瓊膠酶產生菌，包括假單孢菌屬（Pseudomonas sp.）[4]、假交替單胞菌屬（Alteromonas sp.）[5]、弧菌屬（Vibrio sp.）[6]、船蛆桿菌屬（Teredinibacter sp.）[7]、不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）[8-11]和寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）[12]等，但是普遍存在的問題是這些菌株所產瓊膠酶活性低，多數報道的菌株產瓊膠酶活力在10 U以下、降解瓊膠能力普遍較低，遠未能達到工業化生產瓊膠寡糖的需求[13]，嚴重阻礙了海藻的深加工及瓊膠寡糖的開發利用[14]。迄今只有Sigma公司從大西洋假單胞菌中分離的β-瓊膠酶應用于生產且價格十分昂貴，目前應用范圍僅限于科研工作中[15]。因此，篩選出高產瓊膠酶菌株，對攻克當前瓊膠酶活力低、產量小的難關具備重要的指導意義和應用價值，是我國研究海藻多糖降解酶的首要方向。

因此，本研究選擇富含瓊膠的海洋龍須菜作為瓊膠酶產生菌的分離對象，通過多種不同的篩選培養基，從海洋龍須菜中分離得到產瓊膠酶菌株，對其進行形態學及16S rRNA基因序列分類鑒定、發酵產酶研究，初步探究其酶解產物的抑菌性，旨在獲得新型高產瓊膠酶菌株，為瓊膠酶及瓊膠寡糖的開發利用奠定一定基礎。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

新鮮海洋龍須菜，于2016年8月采自廣東省南澳海域。

X-半海水固體培養基：瓊脂粉15 g，蛋白胨6 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，人工海水配制，pH值7.2。2216E培養基：瓊脂粉15 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸高鐵0.01 g，人工海水配制，pH值7.5。改良后培養基：MgSO4·7H2O 0.1 g，FeSO4 0.1 g，（NH4）2SO4 2 g，K2HPO4 7 g，KH2PO4 3 g，瓊脂粉15 g，人工海水配制，pH值7.2。富集培養基：瓊脂粉2 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，NaCl 20 g，pH值7.0[16]。種子培養基：瓊脂粉2 g，牛肉膏5 g，酵母膏1.5 g，Ca2+ 0.2 g，人工海水配制，pH值7.5。發酵培養基：瓊脂粉2 g，麥芽糖1 g，檸檬酸三銨5 g，酵母膏1.5 g，Mg2+ 0.5 g，Ca2+ 0.2 g，Fe2+ 0.02 g，人工海水配制，pH值7.5。牛肉膏蛋白胨固體培養基：瓊脂粉15 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，pH值7.2。牛肉膏蛋白胨液體培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，pH值7.2。

1.2? ? 主要試劑與儀器

α-pNPG和β-pNPG（麥克林Macklin生產），瓊脂為進口分析純，其他試劑均為國產分析純（均購買自廣東環凱微生物科技有限公司）。SW-CJ-2FD超凈工作臺（Airtech公司），SX-50高壓蒸汽滅菌鍋（Tomy公司），PB-10精密pH計（Sartorius公司），BS423S天平（Sartorius公司），ETC 811 PCR儀（北京東勝創新生物科技有限公司），7230G紫外-可見分光光度計（上海諾科）。

1.3? ? 試驗方法

1.3.1? ? 瓊膠酶菌株的篩選。將從南澳島采集到的海洋龍須菜，采用均質法和振蕩法制備樣品，取懸液接入富集培養基進行富集培養，對其進行系列稀釋，制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 一系列梯度稀釋菌懸液。依次涂布3個平板，并將涂布后的平板置于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養2～7 d，觀察其菌落的生長狀況和特征。挑取周圍具有明顯水解圈或凹陷的菌落，在X-半海水固體培養基平板上進行3次以上劃線純化培養，將分離到的菌株平板點接培養后進行盧戈氏碘液染色，觀察菌落周圍產生的水解透明圈大小情況以便進行下一步試驗。

1.3.2? ? 菌株的形態學觀察及鑒定。將挑選獲得的高產瓊膠酶菌株，經平板劃線后置于28 ℃恒溫培養箱培養18～24 h，肉眼觀察其菌落形態特征。菌株的革蘭氏染色、芽孢染色試驗等參照《常見細菌系統鑒定手冊》[17]。

1.3.3? ? 菌株的16S rRNA基因序列擴增、比對及系統發育分析。挑取少許活化菌體利用煮沸法對其進行破壁處理，作為PCR模板DNA。PCR引物分別選取細菌鑒定擴增通用引物27F（5′-AGAGTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGCTAC CTTGTTACGACTT-3′）。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交由上海生工生物工程股份有限公司進行16S rRNA基因序列分析測定，將分析結果通過美國國家生物信息中心NCBI（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov）在GenBank上進行BLAST序列分析比對，分析待檢菌株與其他菌株的同源關系，挑選與待檢菌株相似度較高的模式菌，采用軟件Mega 7.0建立系統發育樹。

1.3.4? ? 瓊膠酶活力的測定。

（1）標準曲線的繪制。精確量取0.100 g干燥至恒重的半乳糖于100 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解，并定容至100 mL作為標準半乳糖溶液（1 mg/mL），準確依次量取該溶液0、0.200、0.400、0.600、0.800、1.000、1.200、1.400、1.600 mL分別置于9支25 mL具塞比色管中[18]。按表1數據加入適量溶液，經沸水浴處理5 min，冷卻定容至25 mL，得到半乳糖標準濃度為0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.040、0.048、0.056、0.064 mg/mL，震蕩搖勻后于波長540 nm下測OD值，并繪制標準曲線。

（2）DNS法測定瓊膠酶酶活。挑取活化后的菌株2～3環接入裝有60 mL培養液的100 mL種子培養基中，于28 ℃搖床培養18 h后，按4%接種量轉接到裝有100 mL培養液的500 mL搖瓶發酵培養基中，于28 ℃ 180 r/min振蕩培養30 h后，取適量發酵液于4 ℃、5 000 r/min冷凍離心10 min，緩慢倒取上清液，即得發酵粗酶液進行下一步研究。

采用DNS測定還原糖的方法測定瓊膠酶酶活力[19]。具體步驟如下：取100 μL粗酶液加入1 mL以NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制而成的瓊脂底物中，置于適宜溫度條件下45 ℃水浴處理30 min后，加入1.5 mL已在相同溫度條件下預熱的DNS溶液中，煮沸5 min，經冷卻后加入蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻，于波長540 nm處測定吸光值;以滅活處理的粗酶液為對照，利用半乳糖為標準品制作標準曲線，根據半乳糖標準曲線確定酶降解底物所產生還原糖的量[16]。將瓊膠酶的活力定義為：在上述反應處理條件下，1 mL酶液1 min產生1 μg還原糖作為1個酶活力單位（U/mL）[20]。

瓊膠酶活力（U/mL）=半乳糖含量（mg）×1 000×粗酶液（mL）×稀釋倍數/反應體系中酶液加入量（mL）×時間（min）[16]

1.3.5? ? 菌株生長曲線及產酶曲線的測定。利用滅菌接種環取活化菌株2～3環于配制好的種子培養基中，于28 ℃下恒溫培養18 h后，依照4%比例接種至改良發酵培養基中，于28 ℃、180 r/min下搖床培養，定期取樣于波長600 nm處測量其稀釋10倍后菌液的吸光值，計算菌株生物量，并測定該粗酶液的產酶活力和pH值，繪制該菌株的生長曲線及產酶曲線。

1.3.6? ? 瓊膠酶類型的鑒別。參照Temuujin U[21]，馬芮萍[12]等的方法，對照組、試驗組各取1 mL 50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH值7.0）與400 μL 4 mg/mL pNPG（α-pNPG和β-pNPG）置于45 ℃環境恒溫水浴預熱5 min。在試驗組中快速加入1 mL在相同溫度條件下預熱好的新鮮酶液，對照組則加入高溫煮沸滅活的酶液作為對照，混勻后均置于45 ℃水浴加熱1 h，再加入1 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應，快速測定在波長420 nm下的吸光度值。

1.3.7? ? 酶解產物抑菌性的測定。將發酵的粗酶液加入0.3%瓊膠底物中，于45 ℃條件下振蕩水浴90 min，160 r/min。所得樣品于5 000 r/min離心10 min后取上清液，經200目篩過濾器得到的無菌瓊膠寡糖溶液于4 ℃貯存備用。將指示菌株大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種適量于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于37 ℃搖床恒溫培養16～18 h。取0.9%無菌生理鹽水配制成菌懸液，用移液槍吸取100 μL稀釋菌液進行平板涂布。待平板表面無液體時，用無菌鑷子取濾紙片貼在平板相應區域，吸取100 μL瓊膠寡糖溶液于濾紙片上[22];平板中間的濾紙片加等量50 μg/mL氨芐青霉素作對照。其中，分別將指示菌株設為1組，各組均有1個陽性對照和1個陰性對照。陽性對照為只涂布指示菌株溶液的平板，陰性對照為只涂布無菌0.9%生理鹽水的平板。將上述平板置于37 ℃培養箱中恒溫培養16～18 h后，及時觀察其抑菌效果。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 產瓊膠酶菌株的分離篩選及形態學觀察

2.1.1? ? 產瓊膠酶菌株的篩選。從采集到的海洋龍須菜樣品中分離篩選得到18株產瓊膠酶菌株，其中1株菌株編號為ZXY772。對ZXY772菌株進行盧戈氏碘液法染色后，菌落四周形成較明顯的透明圈，透明圈直徑約為11.21 mm，如圖1所示。由此表明該菌株對瓊膠具有較顯著的降解能力[23]。

2.1.2? ? 產瓊膠酶菌株的形態學觀察。菌株平板分區劃線結果和單染色鏡檢結果如圖2所示，菌株ZXY772在瓊脂平板上有明顯的凹陷，在平板上可形成圓形菌落，菌落直徑約為1～2 mm，因培養時間不同呈淡黃色至黃色，菌落表面微隆起，濕潤光滑，邊緣整齊。該菌株為革蘭氏陽性（G+）細菌，短桿形至近球形，有明顯的桿、球周期變化，呈V形排列，無芽孢。

2.2? ? 菌株的16S rRNA基因序列擴增、比對及系統發育分析

將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖3所示，在約1 500 bp處得到1條清晰、通亮、單一的條帶，符合預期長度。將PCR擴增產物送往上海生工生物工程有限公司進行基因測序，經拼接獲得1022個堿基序列，將分析結果交到GenBank數據庫上（登錄號XY4GUF9D014）。將測序所得基因序列在NCBI上通過BLAST與GenBank數據庫的序列進行比對，菌株ZXY772的16S rRNA基因序列與Arthrobacter nicotianae strain BS23、Arthrobacter nicotianae strain S2、Arthr-obacter nicotianae strain YNA111等節桿菌屬細菌的序列相似度達到99%，因而可初步判定ZXY772為節桿菌屬（Arth-robacter sp.）。將這些相似性達到98%以上的模式菌株序列，采用軟件MEGA7.0進行模式菌同源比對，進而構建系統發育樹，結果如圖4所示。

從系統發育樹上看，菌株ZXY772與Arthrobacter nicot-ianae strain BS23，Arthrobacter nicotianae strain VITNJ6等聚為一簇，構建出的bootstrap達到99%，綜合革蘭氏染色結果、16S rRNA序列相似性，可鑒定菌株ZXY772為1株節桿菌屬細菌（Arthrobacter sp.）。

2.3? ? 菌株的生長曲線及產酶曲線

取種子液依照4%接種至發酵培養基中，置于28 ℃、180 r/min條件下進行搖床振蕩培養，每隔一定時間定期取樣，測定菌株ZXY772的生物量、產酶活力和pH值。測定產酶活力的半乳糖標準曲線見圖5。

菌株ZXY772的生長特性與產酶活性并非成完全正相關（圖6），其生長特性與細菌的生長繁殖規律一致，0～3 h時為菌株生長繁殖的延滯階段，生長極其遲緩;在3 h以后即開始進入菌株生長的對數期;3～14 h期間，菌體生物量快速上升，培養基中發酵液的pH值由7.25升至8.28，猜測是由于培養基組分中的檸檬酸三銨經菌體代謝后產生某種堿性物質;14～33 h處于相對穩定期。其中，當培養21 h時，菌體密度達到最大值;同時在這一時期，培養27 h時，發酵液酶活力升至最大值，酶活力達到96 U/mL。隨后發酵液中死亡菌體數逐漸上升，進入了衰亡期，pH值由8.28升至8.81，可能是由于菌體衰亡、自溶導致pH值迅速上升;也可能是由于碳源被利用完，菌體被迫利用胞內有機酸所致。27 h后隨著菌體衰亡，死亡菌體數密度逐漸增大，發酵液的產酶活力逐漸降低，酶活力幾乎接近0。

2.4? ? 菌株瓊膠酶類型的鑒定

將菌株ZXY772發酵得到的粗酶液分別和α-pNPG與β-pNPG混合反應1 h。結果顯示，粗酶液與α-pNPG的混合液反應前后在420 nm處的吸光度值均為0.223，無變化;粗酶液與β-pNPG的混合液反應前后在420 nm處的吸光度值分別為0.201、0.234。粗酶液可以作用于含有β-糖苷鍵的 β-pNPG，未作用于含有α-糖苷鍵的α-pNPG。由此可推斷，該菌株胞外只產β-瓊膠酶。

2.5? ? 菌株酶解產物的抑菌結果

利用濾紙片法檢測菌株ZXY772的酶解產物對指示菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌活力。數據表明，菌株ZXY772的瓊膠酶解產物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有較大的抑制圈，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為6.83 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為7.51 mm，對枯草芽孢桿菌的抑菌活力最高，透明圈直徑達到14.45 mm。

3? ? 討論

當前，國內外與瓊膠酶產生菌相關資料中鮮少有人報導過節桿菌屬，其是1株新型的瓊膠酶產生菌株。通過結合形態學特征和分子鑒定結果，可判定菌株ZXY772是1株新型的產瓊膠酶節桿細菌。其中，相比相同研究領域的瓊膠酶酶活：2012年已申請專利的應國清等[24]利用類芽孢桿菌發酵產瓊膠酶活力為53.72 U/mL;2014年馬芮萍等[12]分離的Stenotrophomonas sp. NTa.，經過改良優化后的瓊膠酶活力僅有1.98 U/mL;2017年由張建美等[25]對篩選獲得的產瓊膠酶菌株Vibrio sp.Ag-1進行發酵優化，其最高酶活僅為45.51 U/mL;2018年Leema Roseline T等[9]對分離得到的瓊膠酶菌株Acinetobacter sp. PS12B進行產酶條件優化，酶活由1.52 U/mL增加到45.76 U/mL。本研究經過采用改良后的發酵培養基培養，酶活達到了比較高的水平，穩定在96 U/mL，這在國內外已報道瓊膠酶的相關文獻中屬于較高水平，具有良好的開發前景。瓊膠酶水解瓊膠得到的產物瓊膠寡糖具有良好的抑菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、增強免疫、美白保濕等藥理活性，已成為國內外的研究熱點。然而，關于瓊膠寡糖抑菌作用的相關研究報導較少。本試驗從海洋龍須菜上分離篩選獲得的瓊膠酶產生海洋細菌ZXY772的酶解產物具有較為顯著的抑菌活性。相信通過后續優化其發酵工藝，可進一步提高瓊膠酶產量;同時對酶解產物的抑菌、抗氧化能力等應用方面深入研究，有望開發應用功能性低聚糖瓊膠寡糖。

4? ? 參考文獻

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