S1P、Eotaxin在不同PAI-1基因型老年支氣管哮喘中的表達及其與氣道高反應及肺功能的相關性研究

近年來,隨著我國老齡化進程的加快以及生態環境的惡化,老年支氣管哮喘的發病率、死亡率呈遞增趨勢。老年哮喘發病機制復雜,目前暫無特異性的治療方法。研究者認為哮喘與氣道重塑、平滑肌收縮、肥大細胞的活化脫顆粒等有關,受炎癥因子、基因多態性的影響[1]。據報道,1-磷酸鞘氨醇(S1P)通過S1P/鞘氨醇激酶信號通路促進炎癥介質釋放，誘導應力纖維形成，促進氣道平滑肌和纖維細胞生長分化，導致氣道重塑[2];嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)通過引發嗜酸性的粒細胞炎癥誘導哮喘發生[3];纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)基因4G/5G基因型是老年哮喘發病的易感基因,通過加重細胞外基質沉積促進氣道重塑進程[4]。S1P、Eotaxin水平及PAI-1基因多態性均與哮喘氣道高反應性和氣道重塑有關,而PAI-1基因多態性是否與S1P、Eotaxin水平有關,目前臨床報道較少。本研究探討S1P、Eotaxin水平在不同PAI-1基因型老年支氣管哮喘中的表達差異及與氣道高反應及肺功能的相關性,現將結果報道如下。

1 病例資料

1.1 基本資料 選取我院2017年1月至2018年1月收治的55例緩解期老年哮喘病人作為哮喘組,男30例,女25例,年齡65～90歲,平均(76.1±3.5)歲,病程2～17年,平均(12.2±2.2)年。另選擇同期來我院體檢的50例健康人群作為對照組,男30例,女20例,年齡65～90歲,平均(75.2±3.1)歲。2組性別、年齡等基線資料差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得我院倫理委員會批準。

納入標準:(1)符合《中國支氣管哮喘防治指南 (基層版)》中的哮喘診斷標準[5];(2)年齡≥60歲;(3)無其他呼吸系統疾病合并癥;(4)所有病人及其家屬知情同意,并簽署知情同意書。

排除標準:(1)合并嚴重肝、腎、心腦血管疾病者;(2)入組前4周使用全身糖皮質激素者;(3)入組前1周使用抗組胺、抗白三烯及緩釋茶堿藥物者;(4)合并肺炎、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病或其他部位炎癥病人;(5)合并腫瘤者。

1.2 方法

1.2.1 PAI-1基因型檢測:入院次日,取空腹肘靜脈血2 mL,EDTA抗凝,采用STMT緩沖液處理,采用苯酚/氯仿法提取DNA。引物序列:擴增序列位于5’端啟動子區域,上游、下游引物分別為:5′-CACAGAGAGAGTCTGGCCAGT-3′、5′-CAGCCACGTGATTGTCTAGGT-3′。PCR擴增反應條件:25μL反應體系(含100 ng基因組DNA、0.3μmol引物、1.0 U的Tag DNA聚合酶),94 ℃預變性5 min,94 ℃/30 s、57 ℃/30 s、72 ℃/30 s循環35次,72 ℃延伸10 min;采用限制性內切酶消化PCR產物,25μL反應體系(5μL PCR擴增產物,10 U限制性內切酶BseLI),37 ℃持續3 h,采用12%的PAGE電泳分型,硝酸銀染分析基因型。共產生3種基因型: 5G/5G 、4G/5G、4G/4G,分別產生2(96bp、46bp)、3(74 bp、46 bp、22 bp)、4(96 bp、74 bp、46 bp、22 bp)條帶。

1.2.2 血清PAI、S1P、Eotaxin檢測:取空腹肘靜脈血,置于肝素抗凝管中,37 ℃孵育10 min,3000 r/min離心10 min,取上層血清,采用ELISA測定血清PAI、S1P、Eotaxin水平,具體操作參照試劑盒(購自于上海信帆生物科技有限公司)說明書進行。

1.2.3 氣道反應性評估:采用德國JEAGER公司的定量霧化裝置、日本美能的AS-407肺功能儀及激發藥物磷酸組織胺測定哮喘病人氣道反應性,具體步驟如下:病人依次吸入生理鹽水、0.01/0.02/0.04/0.16/0.26/0.68/1.27 mg的激發藥物,每吸入1劑2 min后測定第1秒用力呼氣量(FEV1),然后吸入下一劑量,直至FEV1下降20%或最高吸入劑量累計達到2.44 mg。數據評估:若累計劑量低于2.44 mg,FEV1降低20%視為激發試驗陽性,記錄激發藥物累計劑量(PD20)。參照氣道反應性分級標準,采用PD20評估氣道高反應性:極輕度(PD20在0.99～2.20 mg)、輕度(PD20在0.25～0.98 mg)、中度(PD20在0.03～0.24 mg)和重度(PD20<0.03 mg)。

1.2.4 肺功能評估:采用德國Yeager肺功能檢測儀器測定哮喘病人FEV1和用力肺活量(FVC),計算FEV1/FVC,采用FEV1/FVC評估病人肺功能。

2 結果

2.1 支氣管哮喘病人與健康人群PAI-1基因型分布、S1P、Eotaxin、PAI-1水平比較 哮喘組與對照組PAI-1基因型分布、S1P、Eotaxin、PAI-1水平差異具有統計學意義(P<0.01),哮喘組PAI-1基因型以4G/4G為主,血清S1P、Eotaxin、PAI-1水平高于對照組。見表1。

表1 支氣管哮喘病人與健康人群PAI-1基因型分布及S1P、Eotaxin、PAI-1水平比較

注：與哮喘組比較，**P<0.01

2.2 不同PAI-1基因型病人S1P、Eotaxin、PAI-1水平比較 老年哮喘病人不同PAI-1基因型血清S1P、Eotaxin、PAI-1水平差異具有統計學意義(P<0.05),基因型4G/4G的病人血清S1P、Eotaxin、PAI-1水平顯著高于基因型為4G/5G、5G/5G的哮喘病人。見表2。

PAI-1基因型PAI-1(ng/mL)S1P(mmol/L)Eotaxin(μg/L)4G/4G(n=24)64.32±3.47?2.48±0.190.139±0.0334G/5G(n=25)52.12±3.121.40±0.10?0.099±0.011?5G/5G(n=6)51.82±3.921.41±0.08?0.099±0.014?

注:與4G/4G組比較,*P<0.05

2.3 PAI-1、S1P、Eotaxin與氣道反應性、肺功能相關性分析 單因素、Logistic回歸分析顯示,吸煙史(定義無吸煙史=1,有吸煙史=2)、PAI-1基因型(定義5G/5G=1,4G/5G=2,4G/4G=3)、PAI-1水平(定義“PAI-1< 49 ng/mL”=1,“PAI-1≥49 ng/mL”=2)、S1P水平(定義“S1P<1.42 mmol/L”=1,“S1P≥1.42 mmol/L”=2)、Eotaxin水平(“Eotaxin<0.1μg/L”=1,“Eotaxin≥0.1μg/L”=2)均與氣道反應性(定義極輕度和輕度=1,中度和重度=2)、肺功能(定義“FEV1/FVC≥55%”=1,“FEV1/FVC<55%”=2)顯著相關(P<0.05),是影響氣道反應性、肺功能的獨立危險因素。見表3、4、5。

2.4 PAI-1與S1P、Eotaxin相關性分析 Spearman相關性分析顯示,PAI-1基因型(定義5G/5G=1,4G/5G=2,4G/4G=3)、PAI-1水平與S1P、Eotaxin呈顯著正相關(r=0.455～0.653,P<0.05);S1P與Eotaxin呈顯著正相關(r=0.705,P<0.001)。見表6。

表3 影響氣道反應性、肺功能的單因素分析

注:項目組內比較,*P<0.05

3 討論

支氣管哮喘是在環境因素、遺傳因素共同作用引起的慢性氣道炎癥,進而出現氣道結構和功能變化,即氣道重塑。氣道重塑和炎癥反應密不可分,但多數學者認為氣道重塑是炎癥長期作用的結果[6]。然而,遺傳學研究表明,氣道重塑和炎癥反應同時作用,共同介導了支氣管哮喘的疾病進程[7],但二者如何相互作用,導致哮喘進展,業界尚未形成共識。

隨著遺傳學研究的深入,人們發現,基因多態性與氣道重塑密切相關[8]。PAI-1是纖維蛋白溶解系統的主要抑制劑,PAI-1基因調控血漿PAI-1的表達,抑制纖維蛋白溶酶原轉化為纖溶酶,導致細胞外基質沉積,產生氣道重塑。據報道,PAI-1基因是影響血清PAI-1水平的主要基因因素,PAI-1基因4G/5G的基因多態性與哮喘相關,其中4G/4G為哮喘的易感基因型[9]。本研究中,哮喘病人與健康人群PAI-1基因型存在差異,哮喘病人以4G/4G基因型為主;4G/4G基因型病人肺功能較4G/5G、5G/5G差,氣道高反應性程度高,證實了PAI-1基因型與肺功能、氣道反應性存在相關性。PAI-1基因調控血漿PAI-1的表達,其中4G/4G易感基因型病人血漿PAI-1表達較高。高表達的PAI-1除了通過抑制纖維蛋白溶解誘導氣道重塑之外,還通過以下途徑發揮作用：(1)抑制凝血酶、金屬蛋白酶抑制細胞外基質降解;(2)降低轉化生長因子-β釋放,促進膠原合成;(3)促進新生血管生成,與嗜酸性粒細胞、肥大細胞形成調控網絡,促進氣道重塑[10],導致病人肺功能變差。

炎癥反應是誘發哮喘和氣道重塑的另一重要原因。S1P是鞘磷脂代謝產物[11],由巨噬細胞、肥大細胞分泌,通過促進支氣管評價細胞收縮和應力纖維形成，誘導肥大細胞活化以及促進氣道纖維細胞、平滑肌細胞生長分化成肌成纖維細胞,導致炎性介質滲出,出現氣道高反應性和氣道重構。Eotaxin是趨化因子家族成員[12],通過選擇性趨化嗜酸性粒細胞,趨使其向炎癥部位靠攏而誘發哮喘和氣道高反應性。據報道[13],急性發作哮喘病人血清SIP和Eotaxin水平急劇升高。本研究中,哮喘病人血清SIP和Eotaxin高于健康人群,且血清SIP和Eotaxin是氣道高反應性、肺功能減弱的獨立危險因素,提示血清SIP和Eotaxin嚴重影響哮喘疾病進程。

表4 影響氣道反應性的Logistic回歸分析

表5 影響肺功能的Logistic回歸分析

表6 PAI-1與S1P、Eotaxin相關性分析(r)

PAI-1基因型、血清SIP和Eotaxin均與老年支氣管哮喘氣道高反應性、肺功能密切相關,但二者之間的相關性研究報道仍較少。本研究中,基因型4G/4G的病人血清S1P、Eotaxin水平顯著高于基因型為4G/5G、5G/5G的哮喘病人,相關性分析顯示,S1P與Eotaxin呈顯著正相關,PAI-1基因型(定義基因型5G/5G=1,4G/5G=2，5G/5G=3)、PAI-1水平與S1P、Eotaxin呈顯著正相關,提示PAI-1基因型與炎癥反應相互作用,共同介導哮喘的氣道高反應性和肺功能下降,從而導致氣道重塑。PAI-1位于7q2.13-2.2,它的3種多態性與血清PAI-1水平相關。PAI-1 4G/4G上調PAI-1的表達,一方面促進氣道分泌金屬蛋白酶-9增加,另一方面促進肺泡上皮細胞分泌白細胞介素-8(IL-8)、白三烯B4(LTB-4)等上游促炎因子,趨化炎癥細胞,共同加重炎癥反應,介導巨噬細胞、肥大細胞等分泌SIP、Eotaxin等炎癥因子,形成炎性調節網絡,協同加重哮喘。

總之,PAI-1基因型、S1P、Eotaxin是影響老年支氣管哮喘氣道高反應性、肺功能的主要因素,PAI-1基因型與S1P、Eotaxin之間具有相關性,共同介導哮喘的進展,詳細的PAI-1基因型調控S1P、Eotaxin表達的機制有待于后續研究。因此,對于老年支氣管哮喘的治療,應同時抑制PAI-1基因型引起的血清PAI-1及S1P、Eotaxin的高表達,提高療效。