茶多酚對宰后牦牛肉線粒體細胞凋亡和肌肉嫩度的影響

王琳琳 陳煉紅 韓 玲 李 鍵 余群力 蔡自建

(1.西南民族大學生命科學與技術學院， 成都 610041； 2.甘肅農業大學食品科學與工程學院， 蘭州 730070)

0 引言

嫩度是評價肌肉品質的重要指標之一。肉品科學領域早期研究指出，肌細胞內鈣激活酶和組織蛋白酶兩大內源酶系能對肌纖維骨架蛋白進行降解，進而起到改善肌肉嫩度的作用[1]。隨著肌肉嫩化理論的不斷完善，內源性細胞凋亡酶(Caspase)被證實也能降解肌原纖維蛋白，并成為參與宰后肌肉嫩化過程的第三大內源酶系[2]。細胞凋亡是細胞在接受某種信號或某些刺激后發生的一種自主有序的死亡過程，也稱為程序性死亡，它分為內源性線粒體凋亡途徑和外源性死亡受體途徑，其中線粒體凋亡途徑被認為是引起肌肉嫩度改善的主要途徑[3]。而細胞色素c(Cyt-c)從線粒體釋放到胞漿的過程對線粒體細胞凋亡途徑的激活具有重要意義，且此過程與MPTP密切相關。MPTP是位于線粒體內、外膜之間，由多種線粒體蛋白構成的非特異性復合孔道，主要受到線粒體Ca2+超載和ROS介導的氧化應激調控，是近年來研究凋亡途徑激活機制的主要方向[4]。

茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱，也是一種復合型的天然抗氧化劑，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射等功能[5]。在細胞凋亡研究領域，對茶多酚在凋亡發生過程中的作用存在諸多爭議，有研究者指出，茶多酚可通過對抗細胞內氧化應激起到抑制細胞凋亡的作用，也有學者持相反觀點。文獻[6]研究發現，茶多酚可抑制由高糖誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡，同時茶多酚也能對甲基汞所致大鼠大腦皮質神經元的氧化損傷起保護作用，并降低細胞凋亡率[7]。雖然茶多酚在多種細胞模型中都被證實能夠抑制細胞凋亡，但也有學者認為，茶多酚可能通過不同的信號通路和途徑在不同的細胞模型中發揮誘導凋亡作用。文獻[8]研究發現，在羊肉宰后成熟過程中茶多酚可通過促進pro-Caspase-3(Caspase-3酶原)降解激活Caspase-3，進而誘導細胞凋亡的發生。茶多酚也可能通過導致ROS過量積累、激發Caspase級聯反應發生，進而誘導細胞凋亡[9]。茶多酚可劑量依賴地誘導卵巢癌SKOV3細胞發生凋亡，且這種誘導作用可能是通過增加細胞內的ROS水平而實現的[10]。同時，茶多酚活性成分沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)也可通過多種方式誘導細胞凋亡[11]。茶多酚對細胞凋亡途徑的作用受到諸多因素影響，如細胞類型、濃度、信號通路以及活性成分等。目前，在肉品科學領域茶多酚主要作為抗氧化劑和保鮮劑起到改善肌肉品質、延長貨架期的作用[12]。而在肌肉宰后細胞凋亡發生過程中，茶多酚起誘導凋亡作用還是抑制凋亡作用，并對肌肉嫩度造成何種影響，尚未見相關研究報道。

本文以茶多酚處理的牦牛背最長肌為試驗對象，測定肌肉宰后成熟過程中對照組和茶多酚組線粒體氧化應激水平、線粒體氧化損傷程度、線粒體功能特性、線粒體細胞凋亡進程，以及嫩度的變化，探究茶多酚對宰后牦牛肉線粒體氧化應激水平的影響和茶多酚在宰后肌肉成熟過程中對細胞凋亡發生的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：隨機選取平均年齡3.5歲、生長發育良好、體質量相近，在相同飼養環境條件下生長的牦牛10頭(青海百德投資發展有限公司提供)，宰前禁食16～18 h，禁水2 h。

試驗試劑：甘露醇、蔗糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、4-丙磺酸基嗎啉、牛血清白蛋白(BSA)、硫酸銅、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、1-苯胺-8萘磺酸(ANS)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、連二亞硫酸鈉、氯化鈉(KCl)、磷酸鉀(K3PO4)、氯化鎂(MgCl2)、疊氮化鈉(NaN3)，以上試劑均為分析純；SOD(線粒體超氧化物歧化酶)活性檢測試劑盒、MDA(丙二醛)含量檢測試劑盒、羰基含量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Caspase-3活性檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。

1.2 儀器與設備

XH-B型旋渦混合器，江蘇康健醫療用品有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋，北京科偉永興有限公司；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；XHF-D型高速分散內切式勻漿儀，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；RF 5301-PC型熒光分光光度計，日本島津公司；UV2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司；Spectramax M2型酶標儀，美國美谷分子儀器有限公司；BX61型正置萬能顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品采集和處理

宰后從胴體上取背最長肌(Longissimusdorsi，LD)，并迅速將其切成大小相同質量在60 g左右的肉樣，取3塊放入液氮中作為0 h樣品，并將其余肉樣隨機分成兩組，第1組均勻注射質量分數為0.3%的茶多酚溶液(料液比10 g/mL)，未經任何處理的肉樣作為空白對照樣品，將上述樣品置于0～4℃條件下，自然成熟0、6、12、24、72、120、168 h，并在相應時間點取樣后放入-80℃超低溫冰箱中待測。

1.3.2線粒體提取

參照文獻[13]的方法，將牦牛背最長肌肉樣剪碎后置于10倍體積的線粒體分離介質(220 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖和2.0 mmol/L EDTA，5.0 mmol/L 4-丙磺酸基嗎啉和0.5% BSA，pH值7.4)中，用高速勻漿機勻漿。勻漿液于4℃、1 000g離心10 min，相同條件下兩次離心后，取上清液再8 000g離心20 min，所得沉淀為線粒體，上清液為胞漿。用雙縮脲法測定蛋白質量濃度。

1.3.3線粒體ROS水平測定

參照文獻[14]的方法并稍作修改。純化的線粒體懸浮液(蛋白質量濃度0.1 mg/mL)與含有5 μmol/L DCFH-DA熒光試劑的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)混合均勻后，將上述混合溶液迅速轉入37℃水浴鍋中避光孵育15 min，隨后于4℃、12 000g條件下離心8 min，立即用熒光分光光度計測定線粒體熒光強度(激發波長、發射波長分別為488、525 nm)，并將測定熒光強度后的樣品置于熒光顯微鏡下，觀察線粒體熒光水平。

1.3.4SOD活性、MDA含量以及羰基含量測定

參照試劑盒說明書的方法測定線粒體SOD活性、線粒體MDA含量及線粒體羰基含量。

1.3.5線粒體膜流動性測定

參照文獻[15]的方法，取0.3 mol/L甘露醇5.65 mL、5 mmol/L ANS溶液60 μL加入到0.3 mL純化的線粒體懸浮液中，并混合均勻。1 min后用熒光分光光度計測定混合液的熒光強度(激發波長、發射波長分別為400、480 nm)，狹縫寬度5 nm。

1.3.6MPTP開放程度測定

參照文獻[4]的方法，用3 mL MPTP測試介質(230 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖，3.0 mmol/L Hepes，pH值7.4)將純化的線粒體蛋白質量濃度調至0.3 mg/mL，取1 mL定量好的線粒體懸液與3 mL MPTP測試介質混勻后，用紫外分光光度計在540 nm處測定吸光度。

1.3.7線粒體和胞漿中Cyt-c濃度測定

參照文獻[16]的方法，用超聲波儀在冰浴下破碎純化的線粒體，然后取破碎后的線粒體懸浮液和胞漿各1.5 mL，向其中分別加入0.025 g連二亞硫酸鈉并搖勻，最后在520 nm處測定吸光度，并由標準曲線計算線粒體和胞漿中Cyt-c濃度。

1.3.8Caspase-3活性測定

Caspase-3活性參照試劑盒說明書的方法進行測定。

1.3.9MFI測定

參照文獻[17]的方法，取2 g肌肉樣品，加入10倍體積MFI(肌原纖維小片化指數)緩沖液(100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH值7.1)，用勻漿機進行勻漿。勻漿液于4℃、1 000g離心15 min。沉淀用20 mL MFI緩沖液溶解，并于相同條件下離心15 min，棄上清液。向沉淀中加入10 mL MFI緩沖液，混勻后用200目尼龍篩網過濾以除去結締組織碎片。用雙縮脲法測定肌原纖維蛋白懸液的蛋白濃度，并用MFI緩沖液將肌原纖維蛋白質量濃度稀釋至0.5 mg/mL，然后在540 nm處測定吸光度，吸光度乘以200即為MFI。

1.4 數據處理

試驗結果均采用平均值±標準差表示，數據平行測定3次。用SPSS 19.0軟件進行方差分析(ANOVA)，用新復極差法(Duncan)進行多重比較，用Origin 8.5軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 線粒體氧化應激水平

ROS是由線粒體產生的重要信號分子，生理狀態下一定水平的ROS對于細胞增殖和信號傳導具有重要作用，但ROS的過多積累會造成脂質過氧化和蛋白質氧化，細胞內酶的失活以及DNA的氧化損傷，進而引發細胞內部一系列氧化應激損傷，且其被證明是誘導細胞凋亡發生的主要原因之一[18]。目前，主要采用DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS水平，DCFH-DA可以自由穿過細胞膜并被細胞內的酯酶水解生成DCFH(2，7-雙氯熒光素蛋白)，而ROS能將無熒光的DCFH氧化成有熒光的DCF(二氯熒光素)，且綠色熒光越多，說明ROS水平越高[19]。由圖1可知，對照組和茶多酚組線粒體ROS熒光強度均隨著成熟時間延長呈先下降后上升再下降的變化趨勢；成熟過程中，茶多酚組發綠色熒光的線粒體數量明顯少于對照組，說明茶多酚組線粒體ROS水平低于對照組，表明茶多酚處理能在一定程度上降低線粒體ROS水平。

氧化應激是當細胞內ROS的過多積累超過內源性抗氧化防御系統對其的消除能力時過剩的ROS就會參與氧化生物大分子，從而造成細胞毒性或者線粒體損傷的生物學過程[20]。由圖2a(圖中小寫字母表示對照組指標在成熟過程中變化差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示茶多酚組指標在成熟過程中變化差異顯著(P<0.05)；對照組和茶多酚組指標在同一成熟時間點變化差異顯著用“*”(P<0.05)表示，差異極顯著用“** ”(P<0.01)表示，下同)可看出，宰后成熟過程中，對照組和茶多酚組線粒體ROS水平呈先下降后上升再下降的變化趨勢(P<0.05)，與圖1基本吻合，原因可能是宰后缺氧缺血環境致使線粒體ROS不斷增多，但因線粒體基質和線粒體膜中存在的SOD、過氧化氫酶等內源抗氧化酶和非酶抗氧化因子的作用有效清除了部分ROS，但隨著線粒體自身抗氧化能力的減弱，在成熟后期兩組肉樣線粒體ROS水平又呈現上升趨勢，文獻[21]研究發現，在鵝肉成熟早期肌肉中ROS的相對含量也是呈先下降后上升的變化，與本研究結果一致。0～72 h，茶多酚組線粒體ROS水平均極顯著低于對照組(P<0.01)，說明茶多酚通過抑制自由基的鏈式反應顯著降低了線粒體ROS水平進而減弱線粒體的氧化應激強度，并可能進一步對細胞凋亡進程造成影響。SOD是細胞內重要的抗氧化酶之一，可以專一性地清除細胞內的ROS，是線粒體氧化損傷的重要評價指標。如圖2b所示，兩組肉樣線粒體SOD活性整體呈先上升后下降的變化趨勢。24 h后，茶多酚組SOD活性顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于對照組，說明茶多酚能夠通過提高線粒體抗氧化酶SOD活性而對ROS進行清除，起到有效降低線粒體氧化應激水平的作用。

圖1 茶多酚處理對宰后牦牛肉成熟過程中線粒體ROS熒光強度的影響Fig.1 Effects of tea polyphenol on fluorescence intensity of ROS of yak LD muscle during postmortem aging

圖2 茶多酚處理對宰后牦牛肉線粒體ROS水平和SOD活性的影響Fig.2 Effects of tea polyphenol on level of ROS and SOD activity of yak LD muscle during postmortem aging

2.2 線粒體氧化應激損傷程度

過量產生的ROS主要通過攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸進而引起膜的脂質過氧化。MDA可直接反映細胞的脂質過氧化程度，也可間接反映細胞損傷程度，進而可表征細胞的氧化應激損傷的程度[22]。如圖3a所示，宰后6～120 h，茶多酚組MDA含量均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于對照組，說明茶多酚通過提高肌細胞線粒體SOD活性清除ROS的同時，有效降低了線粒體脂質過氧化程度，有研究證實茶多酚處理確實通過抑制細胞脂質過氧化而降低了由ROS造成的氧化應激損傷[23]；茶多酚也可通過降低MDA含量，增強SOD活性而影響凋亡，起到抵抗乳腺上皮細胞氧化應激損傷的作用[24]；但也有研究指出，茶多酚并未通過降低細胞內ROS水平降低細胞的氧化應激水平，與本研究結果不一致，反而起相反作用[25]。

細胞內過量產生的ROS不只攻擊線粒體膜上的不飽和脂肪酸，同時也會引起蛋白質的羰基化和蛋白質之間的交聯和聚集，造成蛋白質氧化進而影響正常蛋白質的活性與功能[21]。如圖3b所示，宰后6～72 h，茶多酚組線粒體羰基含量均極顯著低于對照組(P<0.01)，原因是茶多酚顯著抑制了線粒體蛋白質的氧化，降低了線粒體的氧化應激損傷程度。氧化應激引起的線粒體膜脂質和蛋白質的過氧化，會不同程度地降低線粒體膜的流動性，其也可用來評判線粒體膜的氧化損傷情況[26]。由圖3c可知，宰后6～24 h和120 h，茶多酚組線粒體膜流動性均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于對照組，也進一步證實茶多酚通過降低線粒體氧化應激水平，降低了線粒體氧化應激損傷，提高線粒體膜流動性，對線粒體起到保護作用。

圖3 茶多酚處理對宰后牦牛肉線粒體氧化損傷程度的影響Fig.3 Effects of tea polyphenol on degree of oxidative damage to mitochondria of yak LD muscle during postmortem aging

2.3 線粒體功能

線粒體被認為是細胞凋亡發生的中樞調控者，對凋亡過程起著極其重要的調控作用，而作為線粒體進行內外信息傳遞的樞紐，MPTP的開放狀態是線粒體調控細胞凋亡發生的重要環節，MPTP的開放程度直接關系到線粒體Cyt-c的釋放情況以及凋亡的發生進程[27]。有研究指出，肌細胞在嚴重缺氧的應激狀態下時，線粒體ROS大量產生，促使線粒體內外膜間的MPTP構象改變，形成孔道后使線粒體內外膜間的各種促凋亡因子大量釋放，最終引發細胞凋亡級聯反應[28]。由圖4可知，6～12 h，兩組MPTP開放程度無顯著差異，而在成熟24 h后，茶多酚組MPTP開放程度顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于對照組，說明茶多酚通過降低線粒體氧化應激損傷對線粒體結構和功能起到一定的保護作用，也可在一定程度上抑制MPTP介導線粒體Cyt-c的釋放，可能對線粒體細胞凋亡進程起到阻礙作用。文獻[29]研究指出，H2O2處理后的牦牛肉在宰后成熟過程中MPTP的開放程度均強于對照組和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理組，且NAC處理組MPTP的開放程度最弱，與本研究類似，均表明抗氧化劑起到保護線粒體功能的作用，降低了MPTP的開放程度，進一步對細胞凋亡級聯反應起抑制作用。

圖4 茶多酚處理對宰后牦牛肉成熟過程中MPTP開放程度的影響Fig.4 Effect of tea polyphenol on MPTP opening of yak LD muscle during postmortem aging

2.4 成熟過程中細胞凋亡進程

2.4.1線粒體Cyt-c釋放程度

Cyt-c作為線粒體呼吸傳遞鏈中的基本成分，在氧化還原和能量代謝過程中發揮重要作用，同時Cyt-c在線粒體細胞凋亡途徑的激活中也起到重要的調控作用。當MPTP開放并伴隨線粒體膜電位下降時，Cyt-c從線粒體釋放到胞漿中后，與胞漿中Apaf-1(凋亡蛋白活性因子-1)和Caspase-9前體結合形成凋亡小體，激活下游Caspase-3，并引發Caspase級聯反應信號逐級放大最終誘導凋亡發生，Cyt-c的釋放程度對線粒體凋亡的發生具有非常重要的介導作用[30]。由表1分析可知，宰后成熟過程中(6～168 h)，茶多酚組線粒體Cyt-c濃度均高于對照組，并在12 h和72 h存在顯著差異，說明茶多酚通過防護線粒體氧化損傷以及對其功能的保護作用，減弱了MPTP對Cyt-c的釋放。宰后6～12 h，茶多酚組胞漿Cyt-c濃度顯著低于對照組，說明茶多酚在成熟早期顯著抑制了線粒體Cyt-c的釋放；同時，成熟72 h后，茶多酚組胞漿Cyt-c濃度均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于對照組，表明隨著茶多酚抗氧化能力的減弱，線粒體在成熟后期受到ROS介導的氧化應激損傷，使其大量釋放Cyt-c而導致胞漿Cyt-c增多。

表1 茶多酚處理對宰后牦牛肉成熟過程中Cyt-c釋放程度的影響Tab.1 Effect of tea polyphenol on release of Cyt-c of yak LD muscle during postmortem aging

2.4.2Caspase-3活性

細胞凋亡的發生受到諸多因素影響，其中ROS介導的氧化應激被認為是誘導凋亡發生的主要因素之一，也是近年來的研究熱點。上述結果表征了茶多酚對線粒體氧化應激的影響，進而推測茶多酚可能會因對ROS的清除作用而影響其對細胞凋亡的介導作用。如圖5所示，宰后6～12 h，茶多酚組Caspase-3活性顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于對照組，說明與對照組相比，茶多酚確實在成熟早期通過抑制線粒體Cyt-c的釋放而抑制了Caspase-3的激活，進而抑制了凋亡信號的逐級放大。而24～72 h，茶多酚組Caspase-3活性顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于對照組，說明隨著茶多酚抗氧化作用的減弱，對線粒體的保護作用相應下降而導致胞漿中不斷增加的Cyt-c起到介導線粒體凋亡發生的作用；然而也有研究指出，羊肉經茶多酚處理后反而促進了線粒體Cyt-c的釋放和Caspase-3的激活，與本研究結果相反，原因可能是所選骨骼肌類型和所探討的分子機制不同[8]。而在成熟后期(120～168 h)，茶多酚組Caspase-3活性低于對照組，原因可能是茶多酚通過影響Bcl-2家族蛋白表達而對凋亡過程進行調控[31]。

圖5 茶多酚處理對宰后牦牛肉成熟過程中Caspase-3活性變化的影響Fig.5 Effect of tea polyphenol on changes in Caspase-3 activity of yak LD muscle during postmortem aging

Bcl-2家族蛋白是線粒體凋亡途徑的主要調控者，Bcl-2(抗凋亡蛋白)和Bax(促凋亡蛋白)二者比例的變化對凋亡發生具有重要調控作用，當Bax/Bcl-2比例下降時會進一步抑制凋亡發生[32]。ROS介導的氧化應激也會通過提高Bax/Bcl-2的比例而誘導凋亡發生，抗氧化劑則可通過降低Bax/Bcl-2的比例抑制線粒體Cyt-c的釋放，進而抑制凋亡級聯反應擴大[33-34]。同時，茶多酚可抑制在H2O2介導下牙周膜細胞的活性降低、凋亡程度升高，MDA含量增加伴隨SOD活性降低，Caspases和Bax的表達升高以及Bcl-2的表達降低，說明茶多酚通過減輕細胞氧化應激損傷，抑制線粒體細胞凋亡進程而對牙周膜細胞起保護作用[35]，與本研究結果類似。然而，也有研究指出茶多酚通過提高細胞內ROS水平，加劇線粒體損傷誘導卵巢癌細胞凋亡[10]，與本研究結果不一致，原因可能是所用細胞類型以及參與機制不同，相關具體機制有待進一步研究。

2.5 成熟過程中肌肉嫩化

肌肉宰后成熟過程中，肌原纖維蛋白如伴肌動蛋白、伴肌球蛋白、肌間線蛋白以及肌鈣蛋白-T等骨架蛋白的降解促使肌原纖維M線消失、I帶和Z線斷裂，進一步導致肌原纖維有序排列遭到破壞，細絲結構弱化進而增加MFI，最終達到嫩化目的[34]。同時，MFI常被用來作為肌肉嫩化程度的評價指標。如圖6所示，隨著成熟時間的延長，兩組肉樣MFI均呈顯著上升變化規律(P<0.05)，說明宰后成熟過程中肌肉嫩化過程不斷進行，肌肉嫩化程度不斷增強，肌肉嫩度不斷得到提高，文獻[17]研究也證實在牦牛肉宰后成熟過程中MFI呈顯著上升趨勢，與本研究結果一致。同時，成熟早期(6～24 h)，茶多酚組MFI均極顯著低于對照組(P<0.01)，說明茶多酚通過抑制線粒體細胞凋亡進程進一步抑制了其對肌肉嫩度的改善作用。宰后72 h，隨著茶多酚抑制凋亡級聯反應作用的減弱，Caspases繼續起到降解下游肌原纖維蛋白的作用，從而使肌肉嫩化程度得到增強，但在成熟后期(120～168 h)，可能因茶多酚通過其他方式抑制了凋亡進而對肌肉嫩化起到一定阻礙作用。以上研究說明，茶多酚不僅通過抗氧化作用對肌肉色澤、貨架期等起保護作用，同時也可能通過其他方式或途徑影響肌肉嫩度，具體機制有待進一步研究。

圖6 茶多酚處理對宰后牦牛肉成熟過程中MFI變化的影響Fig.6 Effect of tea polyphenol on changes in MFI of yak LD muscle during postmortem aging

3 結論

(1)茶多酚通過降低線粒體ROS水平和提高線粒體SOD活性，減弱了牦牛肉宰后成熟過程中線粒體氧化應激水平，并進一步抑制了氧化應激對線粒體脂質過氧化和蛋白質的氧化損傷，對線粒體結構和功能均起到一定保護作用。同時，茶多酚通過對線粒體結構和功能的保護，進一步抑制了線粒體Cyt-c的釋放以及Caspase-3的活化，從而抑制了線粒體細胞凋亡級聯反應進程，并最終阻礙了肌肉嫩化過程。

(2)宰后牦牛肉成熟過程中，茶多酚可通過抑制ROS介導的氧化應激對線粒體結構和功能的損傷，起到抑制線粒體細胞凋亡級聯反應改善肌肉嫩度的作用，表明茶多酚在發揮抗氧化劑和保鮮劑作用、提高肌肉品質的同時，通過抑制線粒體細胞凋亡途徑對肌肉嫩化產生不利影響。