TGF-β3,HA,PTHrP對人臍帶間充質干細胞成軟骨分化的影響

周曉旭，彭 俊，胡 海，張映輝，佟明華*，顧為望,*

(1.南方醫科大學實驗動物中心，廣州 510000； 2.南部戰區空軍醫院，廣州 510000；3.五邑大學, 廣東 江門 529020)

1 材料和方法

1.1 實驗材料

胎兒娩出后立即結扎臍帶，無菌處理后放入生理鹽水中，充分洗凈臍動靜脈內的血液，剪成1～2 cm長度。用止血鉗和鑷子分離臍動靜脈，外膜。剪碎臍帶成1 mm3大小的組織塊，用PBS清洗一遍，均勻放置在培養瓶中，加臍帶間充質干細胞培養基，置于37℃，5% CO2的培養箱中培養。48 h后換液，培養。取第三代細胞進行實驗。(經家屬知情同意后取足月健康產婦的新生兒臍帶)

1.2 主要試劑與儀器

間充質干細胞成軟骨分化基礎培養基，丙酮酸鈉，ITS，抗壞血酸，脯氨酸，地塞米松，青鏈霉素(鉑晉生物)，TGF-β3(Peprotech)，透明質酸(山東福瑞達)，PTHrP(Peprotech)，人臍帶間充質干細胞培養基(賽業)，FBS(賽業)，CD34，CD45，CD90，HLA-DR(BD)，RNA提取液(Servicebio)，HyPureTMMolecular Biology Grade Water(HyClone)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)，FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)(Roche)。

流式細胞儀(BD)，顯微鏡(Olympus)，離心機(Anke)，勻漿儀(賽維爾生物)，臺式高速冷凍型微量離心機(DragonLab)，熒光定量PCR儀(ABI)，超凈工作臺(蘇凈安泰)，超微量分光光度計(Thermo)，標準試劑型純水儀(青島富勒姆)，離心管(Axygen Biosciences)，CO2培養箱(NAPCO)。

1.3 實驗方法

1.3.1 人臍帶間充質干細胞的鑒定

流式細胞儀檢測表面抗原：取第3代臍帶間充質干細胞，制成1×106～2×106/mL單細胞懸液，加抗體，避光20 min，PBS洗一遍，用流式細胞儀進行細胞表面標志的測定。

成脂誘導分化：取P3HUC-MSCs，加入成脂誘導分化培養基，培養14 d后，油紅O染色。

寧波舟山港：初步測算，寧波舟山港約13%的美國航線箱量將受到影響。寧波舟山港集裝箱吞吐量中美國航線占比為17%，國際航線受影響程度約2.2%。

成骨誘導分化：P3HUC-MSCs，加入成骨誘導分化培養基，培養21 d后，茜素紅染色。

1.3.2 人臍帶間充質干細胞成軟骨誘導分化

當第2代細胞融合到80%～90%時，用0.25%胰酶消化，獲得第3代臍帶間充質干細胞，計數。取5×105的細胞轉移至15 mL離心管中，250 r/min離心4 min。棄上清，加入1 mL基礎培養基，重懸細胞，重懸后1000 r/min離心5 min，重復一遍。將所得的細胞沉淀用0.5 mL的成軟骨誘導分化完全培養基重懸，重懸后離心1000 r/min離心5 min。離心完畢后，將離心管的管蓋擰松，置于37℃，5% CO2的培養箱中培養。實驗分成7組進行，見圖1。

圖1 誘導成軟骨分化的分組Figure 1 Groupping of the chondrogenic differentiation test

1.3.3 HE染色觀察

培養完成后，用4%多聚甲醛固定，石蠟切片脫蠟置于水中，蘇木素染色，伊紅染色，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3.4 阿利新藍染色觀察

將培養后的樣品用4%多聚甲醛固定，石蠟切片脫蠟置水，阿利新藍染色，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3.5 熒光定量PCR檢測

取出待檢測的樣，檢測標志基因Ⅱ型膠原，X型膠原，SOX9，ACAN的基因表達量。用Trizol法提取總RNA，逆轉錄成cDNA后進行PCR擴增。引物均由Servicebio公司合成，以ACTIN為參照基因，各基因引物序列見表1。數值由2-ΔΔCT計算得出。

表1 各基因引物序列

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 人臍帶間充質干細胞的培養及鑒定

2.1.1 人臍帶間充質干細胞形態學觀察

人臍帶間充質干細胞生長迅速，增殖能力良好，細胞呈“梭形”生長，隨著細胞大量生長后，細胞呈“旋渦狀”生長。見圖2。

圖2 人第三代臍帶間充質干細胞(Bar=500 μm)Figure 2 The third-generation human umbilical cord mesenchymal stem cells

2.1.2 流式細胞儀檢測細胞表面抗原

應用流式細胞儀檢測細胞表面抗原后顯示，CD44和CD90為陽性，陽性率分別為99.69%和99.74%，CD34和HLA-DR的表達率是0.04%和0%，小于2%，符合間充質干細胞的定義。見圖3。2.1.3 成脂成骨誘導分化能力

人臍帶間充質干細胞成脂分化后，經油紅O染色，鏡下可見脂滴被染成橙紅色，見圖4。成骨分化后，經茜素紅染色，鏡下可見鈣質結節被染成紅色，見圖5。

2.2 不同細胞因子組合的人臍帶間充質干細胞成軟骨分化的能力

2.2.1 HE染色

通過G2組和G1組相比，G4組和G3組相比，誘導28 d比21 d形成的軟骨組織染色陽性區域增大，細胞增多，G6組G7組和G5組相比，G7組的陽性染色區域較大，G6組染色較深且分布均勻。培養21 d的三組相比，G1組染色陽性區域最小，細胞聚集在軟骨組織外圍，細胞最少，G3組較G1組染色陽性區域無明顯差別，細胞分布均勻，數量較G1組多，G5組較前兩組染色區域大，細胞較密集。培養28 d的四組相比，G2組染色分布不均，細胞數量較少， G4組G6組染色陽性區域無明顯差別，G4組有部分未染色，細胞較少分布較松散，G6組細胞多，分布均勻且密集，G7組染色區域較大，細胞較多。見圖6。

2.2.2 阿利新藍染色

阿利新藍染色檢測酸性黏多糖，結果同HE染色較一致。見圖7。

2.2.3 熒光定量PCR檢測基因表達量

TGF-β3組和TGFβ3/HA組，培養28 d較21 d，COL2α1、COL10α1、SOX9、ACAN表達量上升。在TGFβ3基礎加入HA后，COL2α1、SOX9、ACAN的表達量增加。差異有統計學意義。再加入PTHrP后，和TGFβ3/HA組比較，COL2α1、SOX9、ACAN的表達量上升，COL10α1的表達量下降，G5組G3組、G6組G4組、G7組G4組、G7組G6組之間均有統計學差異。說明HA，PTHrP可以上調Ⅱ型膠原、SOX9、ACAN的表達量，降低COL10α1的表達量，且加入PTHrP兩周比加入一周效果更好。見圖8。

圖3 人臍帶間充質干細胞流式細胞檢測Figure 3 Human umbilical cord mesenchymal stem cells determined by flow cytometry

圖4 成脂分化圖(Bar=100 μm)Figure 4 Adipogenic differentiation

圖5 成骨分化圖(Bar=100 μm)Figure 5 Osteogenic differentiation

圖6 人臍帶間充質干細胞加入不同細胞因子組合后形成的軟骨組織的HE染色(Bar=200 μm)Figure 6 Morphology of the cartilage tissues in each group, formed by human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with different cytokines. HE staining.

圖7 人臍帶間充質干細胞加入不同細胞因子組合后形成的軟骨組織的阿利新藍染色(Bar=200 μm)Figure 7 Morphology of the cartilage tissues formed by human umbilical cord mesenchymal stem cells in each group, combined with addition of different cytokines. Alcian blue staining.

注：兩兩相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.圖8 各組軟骨的基因表達量Note. Comparison between two groups，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.Figure 8 Expression of the chondrogenic genes in each group

3 討論

軟骨是由軟骨細胞、膠原和蛋白多糖組成，由于無血管、神經及淋巴組織的特性，一旦損傷很難自我修復，一直是臨床亟待解決的難題。隨著組織工程技術和間充質干細胞技術的進步和發展，已經有很多實驗研究表明干細胞向軟骨細胞分化的能力[3-4]。為了讓干細胞向軟骨定向分化，一般是在培養時加入細胞因子或利用生物支架等等，例如轉化生長因子-β家族(TGF-β)、骨形態發生蛋白(BMP)、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維樣生長因子(FGF)、甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)、Ⅱ型膠原透明質酸支架[5-6]。本實驗就是通過HE、阿利新藍染色以及測定Ⅱ型膠原、X型膠原、SOX9、ACAN的表達量來探討TGF-β3，HA及PTHrP三者對人臍帶間充質干細胞成軟骨分化的聯合作用。COLⅡ關節軟骨的重要組成成分，是檢測hUCMSCs向軟骨分化效果的指標。ACAN是軟骨細胞特異性的標志物，基因表達和產物可用于評估軟骨形成[7]。COL2α1、ACAN的表達量高表明成軟骨分化的效果好。X型膠原是軟骨細胞肥大的標志，會使軟骨細胞失去性能，進一步分化導致肥大的軟骨細胞鈣化。SOX9是軟骨發育和成熟過程中的關鍵轉錄因子，多種信號通路在軟骨形成過程中調節S0X9的表達和活性[8-9]。

眾所周知，TGF-β3是經典的成軟骨誘導因子，可以促進軟骨細胞增殖，調節軟骨細胞分化，增強ECM的合成，在軟骨形成過程中起到重要的作用。從本實驗中可以看出，只加入TGF-β3培養21 d就可以誘導hUCMSCs成軟骨分化，培養28 d時，形成的軟骨細胞數量增多，酸性黏多糖增加，COL2α1、SOX9及ACAN的表達量增加。TGF-β3與TGFβR-Ⅱ結合，激活Smad蛋白信號通路，表達Ⅱ型膠原和SOX9[10-11]。

HA是一種酸性黏多糖，是關節滑液和軟骨基質的重要組成成分，有潤滑、保護和營養關節軟骨的作用。在MSCs成軟骨分化的過程中，HA不僅可以用作支架材料，也可以作為調節因子。多項研究證實了HA可以促進軟骨的形成[12-15]，主要是通過與一些細胞表面受體(CD44，CD168，RHAMM等)的相互作用[16-17]。本研究的結果也表明HA和TGF-β3有協同作用。在TGF-β3基礎上加入HA后，明顯可以促進軟骨細胞的增殖，上調COL2α1，ACAN，SOX9的表達量，促進軟骨生成的效果優于單TGF-β3的效果，并且培養28 d效果也優于21 d。

PTHrP是抑制軟骨細胞肥大的重要因素，而細胞肥大的特征之一就是COL-X的增多。本研究的結果表明PTHrP聯合TGF-β3/HA可以抑制COL-10α1的表達量，增加COL-2α1、SOX9、ACAN的表達量，并且PTHrP作用的時間也影響抑制細胞肥大的效果。在添加PTHrP的三組中，雖然從14 d或21 d使用1周的PTHrP，都能促進軟骨生成，抑制細胞肥大，但聯合應用TGF-β3，HA28天，在第14天時加入PTHrP一起培養再培養14 d的效果最好，COL-2α1、SOX9、ACAN的表達量最高，而COL-10α1的表達量最低。多數學者認為，PTHrP通過與Ihh形成負反饋軸來調節軟骨分化，離開細胞周期變成肥大的軟骨細胞分泌Ihh誘導合成PTHrP，作用于PTH/PTHrP受體(PTH1R)，受體激活觸發幾種不同的細胞內信號傳導途徑，包括Gαs/腺苷酸環化酶/環腺苷一磷酸(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)和Gαq/ 11 /磷脂酶Cβ/蛋白激酶C(PKC)等，抑制軟骨細胞持續肥大，使軟骨細胞保持增殖狀態，并且負反饋調節Ihh[18-19]。體外MSC在軟骨形成的第一天開始表達PTHrP，并且隨后下調PTHrP表達，伴隨著促進肥大成熟[20]。當PTHrP合成的水平降至一定程度時，軟骨細胞會停止增生并發生肥大[21]。KIM[22]的實驗結果表明PTHrP可以促進軟骨形成并抑制MSCs體外軟骨形成中的肥大，SOX9，GAG和COL-2α1的表達量增加，COL-10α1的表達量減少，本實驗結果與之相似。有研究表明SOX9會直接抑制軟骨細胞COL-10α1和VEGFA等的肥大基因表達[23-24]。猜測是PTHrP一定程度上通過上調SOX9，抑制COL-10α1的表達。但是也有研究者認為PTHrP限制了軟骨細胞的分化和成熟。PTHrP選擇性抑制X型膠原的合成，對Ⅱ型膠原合成基本沒有影響，而合成X型膠原是軟骨細胞分化成熟的標志,提示PTHrP可抑制軟骨細胞成熟過程[25]。造成這種結果的不同主要考慮是由于使用PTHrP的劑量、分子量、時間等的不同引起的。只有N末端完整的PTH和PTHrP才能有效刺激聚集蛋白聚糖合成[26]。

綜上所述， TGF-β3，HA， PTHrP可以不同程度的促軟骨分化。本實驗表明，這其中聯合應用TGF-β3，HA 28 d，在第14天時加入PTHrP一起培養，這種組合方式促進HUC-MSCs成軟骨分化效果最好，且能抑制細胞肥大。但缺乏相應的體內實驗，下一步將進行動物實驗或進一步研究其具體的信號通路。