肝癌相關指征在化學誘發小鼠肝癌過程中的動態研究

陳 峰，周 磊，蘇 靜，張大維*

(1.吉林省腫瘤醫院，長春 130000； 2.長春中醫藥大學附屬醫院， 長春 130000； 3.吉林大學基礎醫學院，長春 130000)

惡性腫瘤作為世界上危害人類生命健康最嚴重的疾病之一，一直是醫學領域內受到廣泛重視的研究課題[1]。肝癌的發生與免疫功能有著密切的關系，免疫防御功能的降低和免疫監視功能低下易造成體內發生腫瘤[2]。肝癌是一種常見的惡性腫瘤，具有死亡率高、轉移性強等特點[3-5]。隨著科學日新月異的發展，手術、TACE(肝動脈化療栓塞)、局部治療、靜脈化療、生物靶向治療等多種治療方式能夠顯著提高肝癌患者的生活質量，延長部分患者的生命，但適應者數量有限，且術后恢復效果不佳，綜合而言，肝癌的病死率仍居高不下，治療效果欠佳[6]。因此深入研究肝癌的發生機制，了解肝癌發生過程中機體的變化，能夠為后續肝癌的監控和治療提供重要的依據和治療策略[7-9]。建立肝癌動物模型是深入肝癌研究的前提條件，化學誘導法、原位移植法、基因修飾法是常見的三種建模方式[10]。其中化學誘發以操作便捷、價格低廉、易成型且肝癌發生過程與人類相似等特點，被廣泛應用，而化學誘發中尤以DEN(二乙基亞硝銨)的效果最佳，DEN 是一種屬于N-亞硝基的有機物質，能夠誘導很多組織形成腫瘤，例如：肝、胃、造血系統、肺等多種組織[11-13]。利用DEN進行誘導，可對肝產生嚴重的損傷，具有較強的致癌性、致畸性和突變性，最直接的表現是中性粒細胞浸潤，廣泛的小葉出血性壞死，肝細胞異常分裂，膽管增生，纖維化，和橋接壞死，并最終導致肝癌[14]。據研究表明，DEN致癌劑聯合CCL4(四氯化碳)促癌劑能夠縮短誘導周期，同時能夠減少模型動物的死亡率，大大提高成模率[15]。因此，本次試驗選擇DEN聯合CCL4共同誘導小鼠肝癌發生，以達到高效建立小鼠肝癌模型的目的[16-18]。判斷肝癌模型的相關指征主要有模式動物體重變化，形態特征，肝組織結構，肝脾指數，血液中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐和總膽紅素的含量及血清中總蛋白、白蛋白和尿素氮含量變化等[19]。本實驗主要從這幾個方面進行不同時間點的監測，以呈現出小鼠肝癌模型構建過程中相關指征的動態變化趨勢，為肝癌模型構建及其病理研究提供參數和技術依據[19]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物：SPF級30日齡雄性C57BL/6J小鼠42只，體重18～22 g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司[SCXK(吉)-2016-0003]，在吉林大學基礎醫學院動物實驗中心屏障環境下飼養[SYXK(吉)-2018-0001]，并按照3R原則給予人道關懷。該研究已經通過吉林大學基礎醫學院倫理委員會審批，審批編號：2019年49號。

1.2 主要試劑與儀器

二乙基亞硝胺(DEN， Sigma)；四氯化碳(天津市富宇精細化工有限公司)；橄欖油(成都市科龍化工試劑廠)。

多功能酶標儀(型號：HBS-1096)，電子分析天平(型號：FA2204B)，恒溫箱(型號：DHP120)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及造模

對照組(control group)：正常雄性C57BL/6J小鼠21只，常規喂養；模型組(model group)：正常雄性C57BL/6J小鼠21只，常規喂養。

1.3.2 給藥方法

小鼠購入后在屏障環境下進行適應性飼養1 d，第2天針對模型組小鼠首先用DEN進行1次腹腔注射100 mg/kg(生理鹽水配制)；第2周再用DEN進行一次腹腔注射100 mg/kg(生理鹽水配制)，第3周后開始以CCl4和橄欖油(配制體積比20∶80)灌胃，0.05 mL/10 g，每周2次；持續灌胃至第20周，其中從第8周開始，CCl4和橄欖油溶液劑量增加為0.10 mL/10 g。

1.3.3 常規觀察指標及檢測指標

DEN誘發肝癌的過程大概要經過3個階段，即肝硬變前期(1～8周)、肝硬變期(8～14周)、癌變期(14～20周)；分別于造模后4、8、12、16、20、24、28周檢測各項指標，基本能反映出肝癌誘變不同時期的變化特點。

誘癌開始后，每周稱量小鼠體重；分別于造模4、8、12、16、20、24、28周后，隨機選擇模型組小鼠3只，對照組小鼠3只脫頸致死；觀察兩組小鼠肝的形態、顏色、質地和肉眼可見的肝表面癌結節數(拍照留存)；取肝、腎稱重并計算肝、腎/體重比，即肝脾指數。并于20周開始計算小鼠存活率和誘癌成功率，存活率=每組存活的小鼠數/各組小鼠總數 × 100%，誘癌成功率=誘癌成功小鼠數/各組小鼠數 × 100%。

將造模4、8、12、16、20、24、28周后處死的3只小鼠，取肝、腎和脾組織，一部分送去病理檢測，一部分用作轉錄組測序，剩余組織的凍存液氮中以備后續使用。提取血液測定其中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐和總膽紅素的含量及血清中總蛋白、白蛋白和尿素氮含量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠表征及肝癌發生狀況

42只小鼠在肝癌誘發過程中，模型組小鼠死亡2只，一只在建模后的第6周死亡，另一只在建模后的第8周死亡。存活率為90.5%。死亡小鼠進行病理檢測主要表現在肝水腫、充血、有大量炎細胞浸潤。在建模的過程中，對照組小鼠肝無異常變化，肝色澤紅潤，表面光滑(見圖1-1)。模型組小鼠普遍出現食欲下降、毛色暗淡、脫毛、整體狀態差、體重降低等現象，相比對照組小鼠，模型組小鼠的肝組織在不同時期呈現出不同狀況：在建模早期肝體積逐漸增大，顏色仍舊紅潤、質軟、表面光滑，未見結節(圖1-2)；建模中期，小鼠肝重量增加，顏色逐漸變暗、變硬，表面凹凸不平、粗糙，有大小不等的結節，(圖1-3)；建模后期，小鼠肝表面出現大小不一、直徑在1.0～3.0 mm之間的灰白色肝結節(圖1-4)。建模成型后，肝表面粗糙、質硬，可見諸多結節，既有4.0～15.0 mm的單發大結節，也有1.5～3.0 mm的多發灰白色小結節(圖1-5)。模型組存活的19只小鼠中，誘癌成功15只，成功率為78.95%。

圖1 肝癌模型小鼠各階段肝的形態變化Figure 1 Changes of gross appearance of the mouse livers

2.2 各組小鼠體重變化

與對照組小鼠比較，造模前各組組小鼠體重無明顯差異?；瘜W誘導建模第4周時，模型組小鼠平均體重開始下降。造模 4～12周，模型組小鼠體重均低于正常組；造模第12～28周，模型組小鼠均明顯低于正常組小鼠(P<0.05，圖2)。

圖2 各組小鼠體重變化對比Figure 2 Comparison of the changes of body weight in the mice

2.3 各組小鼠肝、腎功能和肝中蛋白含量的變化

實驗測定、分析了不同時期建模組和對照組小鼠的肝腎功能變化，結果表明：模型組小鼠血清中谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、肌酐和總膽紅素顯著升高，說明模型組小鼠肝受到嚴重損傷。與對照組小鼠比較，模型組小鼠血清中總蛋白、白蛋白和尿素氮含量顯著降低，模型小鼠血清中尿素氮可能與小鼠體內低蛋白水平有關，而γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)和堿性磷酸酶(ALP)雖有輕微增高的變化，但變化不明顯(圖3)。

2.4 各組小鼠肝、脾指數變化

模型組小鼠的肝、脾指數均明顯高于對照組，同時，隨著建模時間的延長，肝脾指數逐漸增加，表明建模組小鼠的肝脾受到一定程度的損傷(表1)。

2.5 各組小鼠肝、腎病理結果

成模結束后，選取肝癌模型小鼠和對照組小鼠進行HE染色病理分析，結果顯示：對照組小鼠肝組織結構無異?，F象，肝小葉結構清晰，肝細胞索以中央靜脈為中心向四周整齊排列；而模型組小鼠肝組織逐漸出現異常，建模12周以前，肝的變化主要表現在細胞變大，并呈現空泡狀變化，細胞排列混亂，細胞核都擠向細胞一側，同時能夠觀察到有部分炎性細胞的浸潤，可以看到為數不多的由于肝細胞凝固壞死形成的嗜酸性小體。在建模16周后，模型組小鼠的肝小葉結構逐漸消失不見，形成假小葉，中央靜脈缺失或偏離原來位置，肝細胞索結構紊亂，并出現肝細胞越來越多的壞死，有些會出現空泡狀的變化，細胞核出現大小不一的現象，同時很容易觀察到嗜酸性小體，細胞形狀出現明顯變化。建模20周后，模型組小鼠肝細胞狀態明顯表現出肝癌特征，細胞排列非常紊亂并擁擠，細胞的大小、形態各異，可見巨核，核異型性非常明顯，間質間可見較明顯的炎細胞浸潤(圖4)。

圖3 各組小鼠肝、腎功能和肝中蛋白含量的變化Figure 3 Changes of liver and kidney functions and liver protein contents in the mice

時間Time組別Groups肝指數Liver index脾指數Spleen index4周4 weeks對照組Control group0.59±0.1280.086±0.028模型組Model group0.58±0.1280.085±0.0288周8 weeks對照組Control group0.60±0.1260.084±0.027模型組Model group0.70±0.153?0.093±0.02612周12 weeks對照組Control group0.59±0.1260.086±0.027模型組Model group0.93±0.197?0.101±0.026?16周16 weeks對照組Control group0.58±0.1290.085±0.029模型組Model group1.06±0.226?0.116±0.026?20周20 weeks對照組Control group0.59±0.1260.086±0.027模型組Model group1.20±0.359?0.136±0.030?24周24 weeks對照組Control group0.60±0.1250.086±0.023模型組Model group1.38±0.359?0.140±0.031?28周28 weeks對照組Control group0.58±0.1290.086±0.027模型組Model group1.45±0.412?0.147±0.038?

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

圖4 肝病理圖(HE染色，×200)Figure 4 Pathological changes in the liver tissues of the mice at different stages.HE staining

3 討論

肝癌動物模型的建立是肝癌研究的基礎，而化學誘發小鼠肝癌模型是基礎科學研究和臨床研究中經常使用的模型建立方式，同時由于其類似人類肝癌形成過程，因此，是目前進行肝癌研究的首選建模方式[20-22]。

DEN作為比較常用的化學致癌劑，致癌率較高，因此，常被用作肝癌動物模型的啟動劑和致癌劑[23]。另外，有研究表明，CCL4對肝也具有較大的毒性，也會對肝造成損傷，因此，本實驗通過以DEN為啟動劑進行腹腔注射，在這里經過改良，將一次注射，改為兩次注射，以增加啟動刺激性，為成功建模奠定基礎[19]。而后通過以CCl4和橄欖油混合液進行灌服，聯合誘發小鼠肝癌模型的建立，通過這種方式建立模型的病理變化會經過肝炎、肝硬化、非典型性增生，最后肝癌形成的過程，這些變化過程與人類肝癌形成的變化過程非常相似，另外，此種模型的重復性和穩定性都較好，因此，該模型的建立對研究人類肝癌具有重要作用，為肝癌的治療奠定基礎[19-22]。本實驗以C57BL/6J小鼠為實驗對象，在誘癌實驗早期觀察到模型小鼠的病理改變主要為肝細胞的炎性損傷、增生浸潤引起肝組織的變性和腫大。在誘癌的中-晚期則出現嗜酸性結節小體、空泡結構和肝硬化、肝癌的發生[10,23]。本實驗組肝細胞性肝癌陽性率為78.95%，肝組織均呈明顯肝硬化改變。這些病理改變與人類肝癌在肝硬化的基礎上發生有一定的相似之處[24-25]。小鼠在誘癌實驗過程中死亡的主要原因在早期和中期為誘癌劑的毒性作用引起的中毒性死亡，而在晚期則主要是因為腫瘤晚期動物體質衰竭引起的死亡[26]。

由于致癌劑二乙基亞硝胺(DEN)的化學毒性作用，傳統一次性給藥方法后小鼠在誘癌階段的實驗性死亡明顯增加，影響了誘癌數量及誘癌周期，導致實驗觀察結果的誤差[27]。在本研究中筆者采用化學誘癌劑DEN分次飼喂法結合后期添加一定配比CCl4/橄欖油建模方法，這樣可緩解誘癌劑對建模小鼠的毒副作用，有效地降低了建模小鼠的實驗性死亡率。

本實驗中，通過對模型組小鼠和對照組小鼠體重、肝脾指數、病理、血清中谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、肌酐和總膽紅素及血清中總蛋白、白蛋白和尿素氮含量的檢測獲得了建模不同時期的動態數據。在建模初期各項指標與對照組相差無幾，隨著建模時間的延長，模型組小鼠逐漸表現出肝癌的癥狀。實驗結果顯示，在建模16周左右，建模小鼠各項指標表現出較為顯著的變化，24～28周均表現出明顯的肝癌癥狀，實驗對不同時間節點檢測分析的表征數據能夠很好體現肝癌模型的發展變化。

通過本肝癌小鼠建模實驗，筆者認為：①建模小鼠的分組要合理，每籠動物7～8只，盡可能給動物充足的活動空間；②保證每只動物同時進食，藥量均勻；③飼料、飲水要清潔充足；④由于小鼠有啃食死鼠的習性，如發現精神狀態差、不好動、不進食的動物，要分籠喂養，以防患病小鼠死后被同類吃掉；⑤誘癌劑DEN應按照所需配制濃度充分溶解于生理鹽水。

本實驗結果表明，隨著誘癌時間的延長，小鼠肝硬化程度逐漸加重，肝癌的發生率明顯上升。發生腫瘤的模型小鼠肝表面見有大小不等的灰白色結節，腫塊增大、數量增多并相互融合。說明本實驗所誘發的小鼠肝癌與人類肝癌相似，本模型可以模擬人類肝癌發生、發展的基本過程[28]。