毛木耳黑色素提取條件優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

劉 鑫，袁 源，侯若琳，陳良韜，吳小平，鄭明鋒*，傅俊生*

1福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院；2福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；3福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002

毛木耳(Auriculariapolytricha)屬擔(dān)子菌門、傘菌綱、木耳目、木耳科，是一種天然的食藥兩用真菌。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，富含黑色素、多糖和蛋白質(zhì)等多種活性成分[1-3]。大量研究表明，毛木耳具有良好的抗腫瘤等功效[4]。然而，目前關(guān)于毛木耳的研究?jī)H集中在其蛋白質(zhì)和多糖活性成分，而對(duì)其黑色素活性成分的研究卻鮮有耳聞。以往研究表明，食藥用真菌天然黑色素具有良好抗氧化、抗菌和抗腫瘤等生物活性，對(duì)人體健康作用重要，因而在生產(chǎn)生活中具有巨大的應(yīng)用潛力和價(jià)值[5-7]。

黑色素是一種由酚或吲哚類化合物氧化聚合形成的非均質(zhì)高分子量化合物[8]，溶于堿而不溶于水和其它有機(jī)溶劑，因此通常采用NaOH來提取[9]。本文主要探究了毛木耳黑色素的超聲波輔助提取條件，并對(duì)黑色素體外化學(xué)抗氧化與細(xì)胞抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為毛木耳黑色素高效提取及其產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

毛木耳子實(shí)體干品購于福建省福州市大潤(rùn)發(fā)超市，外觀呈耳狀，黑色，背部有絨毛(由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院傅俊生副教授鑒定)。

1.2 主要藥品試劑

氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、硫酸亞鐵、水楊酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)(Sigma公司)；ABTS(Sigma公司)；四甲基噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司)；DCFH-DA活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)等。

1.3 主要儀器設(shè)備

PS-G60型潔康超聲波機(jī)(潔康超聲波設(shè)備有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；FE-20型pH計(jì)(梅特勒托利多儀器有限公司)；ST16R型離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；CP-214型電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；Varioskan Flash型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)等。

1.4 黑色素含量測(cè)定

通過掃描毛木耳黑色素純品的紫外全吸收光譜，確定了毛木耳黑色素紫外的最大吸收波長(zhǎng)在220 nm處(圖1)，因而在此波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，以氫氧化鈉溶液為空白，繪制毛木耳黑色素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)公式(1)計(jì)算黑色素提取率。

提取率(%)=提取液中黑色素質(zhì)量/

毛木耳子實(shí)體粉末質(zhì)量×100%

(1)

1.5 毛木耳黑色素提取

參照Zou[10]等方法，并作適當(dāng)修改。將干燥的毛木耳子實(shí)體粉碎→過80目標(biāo)準(zhǔn)篩→精確稱取毛木耳子實(shí)體1.00 g，以料液比1∶30加入蒸餾水，90 ℃水浴30 min，10 000 rpm離心3 min，去除上清液，重復(fù)該步驟3次，除去多糖和蛋白質(zhì)等水溶性雜質(zhì)→按一定料液比加入NaOH溶液→在一定的超聲功率和超聲溫度下提取毛木耳黑色素→提取結(jié)束后，于10 000 rpm離心5 min，收集上清液，用HCl將上清液的pH調(diào)節(jié)至1.5→80 ℃水浴加10 h→10 000 rpm離心3 min→收集沉淀，將沉淀依次用蒸餾水、95%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚和75%乙醇洗至溶液無色，6 000 rpm離心去除清洗溶劑→將沉淀用NaOH溶解，再用HCl調(diào)節(jié)pH至1.5使黑色素重新沉淀→離心收集沉淀，將沉淀用0.1 M NaOH復(fù)溶，接著用0.1 M HCl調(diào)節(jié)pH至中性，流水透析48 h→冷凍干燥，得干燥的毛木耳黑色素純品。

圖1 毛木耳黑色素紫外全吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet full absorption spectrum Auricularia polytricha

1.6 超聲波單因素試驗(yàn)

以黑色素提取率為指標(biāo)，分別研究NaOH濃度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mol/L)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)、超聲時(shí)間(10、20、30、40、50、60、70、80、90 min)、超聲功率(200、250、300、350、400、450、500 W)和超聲溫度(20、30、40、50、60、70、80 ℃)五個(gè)因素對(duì)毛木耳黑色素提取率的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

依據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Desig-expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以優(yōu)化超聲波輔助提取的毛木耳黑色素的工藝參數(shù)。響應(yīng)面設(shè)計(jì)表見表1。

1.8 毛木耳黑色素紅外光譜分析

將精制得黑色素粉末與KBr研磨混勻壓片，在紅外光譜儀上測(cè)定，采用2 cm-1的分辨率，掃描60次，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

1.9 毛木耳黑色素體外化學(xué)抗氧化活性分析

1.9.1 ABTS自由基清除率測(cè)定

參照Sun等法[11]，測(cè)定毛木耳黑色素對(duì)ABTS自由基的清除活性，實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次，取平均值。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

1.9.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

參照Saiga等法[12]，測(cè)定毛木耳黑色素對(duì)DPPH自由基的清除活性，實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次，取平均值。

1.9.3 羥基自由基清除率測(cè)定

參照Wang等法[13]。測(cè)定毛木耳黑色素對(duì)羥基自由基的清除活性，實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次，取平均值。

1.10 毛木耳黑色素的體外細(xì)胞抗氧化活性分析

1.10.1 過氧化氫誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞氧化損傷條件的確定

參照Li等[14]法，稍作修改，建立L02肝細(xì)胞氧化損傷模型。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為1.0×105個(gè)/mL，培養(yǎng)24 h后分組培養(yǎng)。分為2組，空白對(duì)照組不加任何處理；模型組用不同濃度(25、50、100、200、400、800 μmol/L)H2O2處理。于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2) -2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測(cè)定細(xì)胞活力，以半數(shù)抑制濃度(IC50)為標(biāo)準(zhǔn)，來確定H2O2的造模濃度[15]。

1.10.2 毛木耳黑色素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞活力影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為1.0×105個(gè)/mL，培養(yǎng)24 h后分組培養(yǎng)。分為4組，空白對(duì)照組不加任何處理；模型組用200 μmol/L H2O2單獨(dú)處理；毛木耳黑色素+H2O2組用不同濃度(1、2、4、6、8 mg/mL)毛木耳黑色素預(yù)處理1 h，再與200 μmol/L H2O2共孵育；樣品對(duì)照組用8 mg/mL毛木耳黑色素單獨(dú)處理。于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。

1.10.3 毛木耳黑色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞形態(tài)的改善作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為1.0×105個(gè)/mL,培養(yǎng)24 h后分組培養(yǎng)。分為3組，空白對(duì)照組不加任何處理；模型組用200 μmol/L H2O2單獨(dú)處理；毛木耳黑色素+H2O2組用6 mg/mL毛木耳黑色素預(yù)處理1 h，再與200 μmol/L H2O2共孵育。分別在0、24、48 h觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.10.4 毛木耳黑色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的L02細(xì)胞活性氧含量的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為1.0×105 個(gè)/mL,培養(yǎng)24 h后分組培養(yǎng)。分為3組，空白對(duì)照組不加任何處理；模型組用200 μmol/L H2O2單獨(dú)處理；毛木耳黑色素+H2O2組用6 mg/mL毛木耳黑色素預(yù)處理1 h，再與200 μmol/L H2O2共孵育6 h。按照試劑盒說明書的方法，運(yùn)用原位裝載探針的方法進(jìn)行胞內(nèi)染色，染色30 min，然后用PBS充分清洗干凈，使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波單因素試驗(yàn)

2.1.1 NaOH濃度

在料液比1∶20、超聲時(shí)間30 min、超聲功率200 W、超聲溫度30 ℃的條件下，研究不同NaOH濃度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mol/L)對(duì)毛木耳黑色素提取率的影響。從圖2A中可以看出，毛木耳黑色素提取率隨著NaOH濃度的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，當(dāng)NaOH濃度達(dá)0.3 mol/L時(shí)，黑色素提取率達(dá)到最大。因此，在NaOH濃度為0.3 mol/L的條件下提取黑色素比較適宜。

2.1.2 料液比

在NaOH濃度0.3 mol/L、超聲時(shí)間30 min、超聲功率200 W、超聲溫度30 ℃的條件下，研究不同料液比(為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)對(duì)黑色素提取率的影響。從圖2B中可以看出，毛木耳黑色素提取率隨料液比的增加呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，當(dāng)料液比超過1∶30后，提取率基本保持不變，考慮到料液比過大會(huì)造成溶劑浪費(fèi)并且不利于后處理，因此，在料液比為1∶30的條件下提取黑色素比較適宜。

2.1.3 超聲時(shí)間

在NaOH濃度0.3 mol/L、料液比1∶30、超聲功率200 W、超聲溫度30 ℃的條件下，研究不同超聲時(shí)間(10、20、30、40、50、60、70、80、90 min)對(duì)毛木耳黑色素提取率的影響。從圖2C中可以看出，隨著超聲時(shí)間的推移，黑色素的提取率逐漸提高，當(dāng)超聲時(shí)間超過50 min時(shí)，黑色素的提取率趨于平衡。因此，在超聲時(shí)間為50 min的條件下提取黑色素比較適宜。

2.1.4 超聲功率

在NaOH濃度0.3 mol/L、料液比1∶30、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度30 ℃的條件下，研究不同超聲功率(200、250、300、350、400、450、500 W)對(duì)黑色素提取率的影響。從圖2D中可以看出，隨著超聲功率的增大，黑色素的提取率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為250 W時(shí)，黑色素提取率達(dá)到最高。當(dāng)超聲功率過高，黑色素的提取率發(fā)生了下降，這可能是由于過高的超聲功率，破壞了黑色素的結(jié)構(gòu)，從而降低了黑色素提取率，因此在超聲功率為250 W的條件下提取黑色素較為適宜。

2.1.5 超聲溫度

在NaOH濃度0.3 mol/L、料液比1∶30、超聲時(shí)間50 min、超聲功率250 W的條件下，研究超聲溫度對(duì)毛木耳黑色素提取率(20、30、40、50、60、70、80 ℃)的影響。從圖2E中可以看出，黑色素的提取率隨超聲溫度的上升而逐漸提高，當(dāng)超聲溫度上升至70 ℃后，黑色素提取率趨于平衡，溫度過高可能會(huì)對(duì)黑色素的活性產(chǎn)生影響，且會(huì)加大能源的消耗。因此，在超聲溫度為70 ℃的條件下提取黑色素比較適宜。

圖2 各超聲單因素對(duì)毛木耳黑色素提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic single factor on extraction rate of melanin from Auricularia polytricha注：與前一條件相比較，*P<0.05。Note:Compared to the previous condition,*P<0.05.

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在超聲波單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取A(NaOH濃度)、B(超聲時(shí)間)和C(超聲功率)為自變量，以黑色素提取率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

通過Desig-expert 8.0.6數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)表2毛木耳黑色素提取率進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到A(NaOH濃度)、B(超聲時(shí)間)、C(超聲功率)3個(gè)因素與Y之間的回歸方程：Y=9.18+0.19A+0.50B+0.42C+0.11AB+0.45AC+0.13BC-2.02A2-1.08B2-1.34C2。對(duì)此回歸模型進(jìn)行方差分析，該模型的P<0.01，說明該模型具有高度顯著性。從表3可知，該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9，說明該模型擬合度較好，可以真實(shí)的描述各個(gè)影響因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。同時(shí)，失擬項(xiàng)不顯著，說明回歸方程與實(shí)際情況吻合的較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程較好的分析和與預(yù)測(cè)最佳提取條件。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化及模型驗(yàn)證

通過對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果分析，可預(yù)測(cè)黑色素最優(yōu)提取條件及提取率，由回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知(表3)，模型的一次項(xiàng)A、B、C影響極顯著(P<0.01)，二次項(xiàng)A2、C2、B2影響極顯著(P<0.01)，交互項(xiàng)AC影響極顯著(P<0.01)；根據(jù)一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值可知，各因素對(duì)毛木耳黑色素提取率的影響主次順序依次為超聲時(shí)間>超聲功率 > NaOH濃度。

根據(jù)回歸分析結(jié)果繪制響應(yīng)曲面，以確定NaOH濃度、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)毛木耳黑色素提取率的影響(圖3)。通過該模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取條件為：NaOH濃度0.34 mol/L、超聲時(shí)間52.48 min、超聲功率259.65 W，在最優(yōu)提取條件下，預(yù)測(cè)的黑色素提取率可達(dá)9.27%。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

來源Source平方和Sumofsquare自由度Df均方MeansquareFPBC10.0680.0684.970.0610失擬Lackoffit32.43E-038.08E-040.0350.9900殘差誤差Residualerror70.0950.014R2=0.9979純誤差Pureerror49.30E-022.30E-02AdjR2=0.9951合計(jì)Total1644.33

圖3 響應(yīng)面法立體分析圖Fig.3 Response surface plot

2.4 模型預(yù)測(cè)結(jié)果驗(yàn)證及其與非超聲組黑色素提取率比較

為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，為便于實(shí)際試驗(yàn)操作，對(duì)超聲功率和超聲時(shí)間參數(shù)進(jìn)行取整，最終實(shí)際的提取條件為NaOH濃度0.34 mol/L、料液比1∶30、超聲功率250 W、超聲時(shí)間52 min、超聲溫度70 ℃。在此條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，3次實(shí)驗(yàn)提取率的平均值為9.38%±0.15%(表4)，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在±0.12%內(nèi)，由此可知，模型預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間有較好擬合性，能較好預(yù)測(cè)和分析不同條件下毛木耳黑色素提取率變化。

為驗(yàn)證超聲波對(duì)毛木耳黑色素提取的促進(jìn)作用，在進(jìn)行最優(yōu)條件驗(yàn)證的同時(shí)，還設(shè)置了非超聲組進(jìn)行對(duì)比(在實(shí)驗(yàn)條件控制上，除不超聲外，其它條件均與超聲組相同)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲波提取組的提取率相比于非超聲組提高了16.09%(表4)，這與其它天然黑色素的超聲提取結(jié)果變化趨勢(shì)相似，表明超聲波可以有效的提高黑色素提取率[16,17]。

表4 超聲波組與非超聲組毛木耳黑色素提取率比較

注：與非超聲組相比較，*P<0.05。

Note:Compared to non ultrasonic group*P<0.05.

2.5 毛木耳黑色素紅外光譜分析

黑色素在紅外光譜中主要有以下主要特征吸收峰：吲哚環(huán)的N-H基團(tuán)和OH基團(tuán)在3300 cm-1左右產(chǎn)生的吸收峰，芳環(huán)C=C鍵或C=O鍵在1650 cm-1左右產(chǎn)生的吸收峰，以及芳環(huán)被取代形成共軛體系后在600～800 cm-1處所產(chǎn)生的弱吸收峰[18,19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，超聲波組與非超聲組提取的毛木耳黑色素紅外光譜主要特征吸收峰一致，表明超聲波對(duì)毛木耳黑色素化學(xué)結(jié)構(gòu)影響較小。

2.6 毛木耳黑色素體外化學(xué)抗氧化活性分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)毛木耳黑色素體外化學(xué)抗氧化活性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，毛木耳黑色素具有良好的化學(xué)抗氧化活性，當(dāng)黑色素質(zhì)量濃度達(dá)4 mg/mL，其對(duì)ABTS、DPPH和羥基自由基的清除率分別達(dá)96.46%±0.98%、55.30%±3.74%、52.80%±5.12%(圖5)，該研究結(jié)果與黑木耳黑色素的抗氧化活性相比，毛木耳黑色素對(duì)DPPH和羥基自由基的清除活性較黑木耳黑色素低[7]，而對(duì)ABTS自由基清除活性與黑木耳黑色素相近[20]。

圖4 超聲波組與非超聲組毛木耳黑色素紅外光譜比較Fig.4 Comparison of infrared spectra of Auricularia polytricha melanin between ultrasonic group and non ultrasonic group

為探究超聲波是否會(huì)對(duì)毛木耳黑色素的抗氧化活性產(chǎn)生影響，實(shí)驗(yàn)同時(shí)還對(duì)非超聲組提取的黑色素化學(xué)抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，超聲波組與非超聲組提取的黑色素清除ABTS、DPPH和羥基自由基的能力相近，表明超聲波對(duì)毛木耳黑色素的抗氧化活性影響不大。

圖5 超聲波組與非超聲組提取的毛木耳黑色素化學(xué)抗氧化活性對(duì)比Fig.5 Comparison of antioxidant activity of Auricularia polytricha melanin between ultrasonic group extraction and non ultrasonic group extraction

2.7 毛木耳黑色素體外細(xì)胞抗氧化活性分析

在確定超聲波對(duì)毛木耳黑色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和體外化學(xué)抗氧化活性影響不大后，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了超聲波輔助提取的毛木耳黑色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，以分析毛木耳黑色素體外細(xì)胞抗氧化活性。

2.7.1 過氧化氫誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞氧化損傷的濃度

研究首先考察了過氧化氫濃度對(duì)L02肝細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果顯示隨著過氧化氫濃度的增加，細(xì)胞的存活率逐漸降低(圖6A)，當(dāng)過氧化氫濃度為200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為50%，本研究選擇造模濃度為200 μmol/L的過氧化氫進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.7.2 毛木耳黑色素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞活力影響

結(jié)果如圖6B所示。與空白組相比，樣品對(duì)照組濃度為8 mg/mL的毛木耳黑色素對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響，表明毛木耳黑色素對(duì)細(xì)胞沒有毒副作用；與模型組(僅給予200 μmol/L H2O2)相比，毛木耳黑色素預(yù)處理能明顯減輕H2O2導(dǎo)致的L02細(xì)胞活力下降，并呈劑量依賴性，當(dāng)毛木耳黑色素濃度達(dá)6 mg/mL時(shí)，L02細(xì)胞存活率可達(dá)87.23%±8.72%(P<0.05)，表明毛木耳黑色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。濃度為8與6 mg/mL的毛木耳黑色素處理組對(duì)L02細(xì)胞的活力影響無顯著性差異，因此選擇濃度為6 mg/mL的毛木耳黑色素進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.7.3 毛木耳黑色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞形態(tài)的改善作用

如圖7A所示，空白組細(xì)胞以靜態(tài)粘附方式生長(zhǎng)，呈梭形或多角形。模型組(僅給予200 μmol/L H2O2)細(xì)胞逐漸收縮，形成球形，與周圍細(xì)胞分離。與模型組相比，毛木耳黑色素能明顯改善由H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變。

2.7.4 毛木耳黑色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的L02細(xì)胞活性氧含量的影響

H2O2可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)，從而對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。從圖7B可以看出，與空白組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量明顯升高，使細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而毛木耳黑色素明顯降低了由H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)ROS升高，進(jìn)一步證實(shí)了毛木耳黑色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

圖6 毛木耳黑色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞活力影響Fig.6 The effects of Auricularia polytricha melanin on H2O2-induced cell viability注：A.H2O2對(duì)L02細(xì)胞活力的影響，與空白組相比，*P< 0.05；B.木耳黑色素(APM)對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞活力影響，與空白組相比較，▲P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。Note:A.The effect of H2O2 on the activity of L02 cells,compared to blank group *P< 0.05;B.The effects of Auricularia polytricha melanin on cell viability induced by H2O2,compared to blank group ▲P< 0.05,compared to model group #P< 0.05.

3 討論

毛木耳因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。黑色素作為毛木耳的主要活性成分之一，在其生物功效上發(fā)揮著重要作用，如何高效提取毛木耳黑色素對(duì)毛木耳的生產(chǎn)應(yīng)用十分重要。超聲波輔助提取法是一種利用超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈的振動(dòng)而引起細(xì)胞壁的破壞，進(jìn)而提高活性物質(zhì)成分提取效率的方法，其具有提取時(shí)間短、提取效率高、環(huán)境污染小和成本低的優(yōu)點(diǎn)[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取法提取毛木耳黑色素，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲輔助提取法提取毛木耳黑色素的最佳提取工藝參數(shù)為：NaOH濃度0.34 mol/L，料液比1∶30，超聲時(shí)間52 min，超聲功率250 W，超聲溫度70 ℃。在最優(yōu)條件下，毛木耳黑色素提取率可達(dá)到9.38%±0.15%，相比于實(shí)驗(yàn)設(shè)置的非超聲組黑色素提取率提高了16.09%，表明超聲波可有效提高毛木耳黑色素提取率。

大量研究表明，過氧自由基與人類許多疾病的發(fā)生有關(guān)，如心腦血管疾病、老年癡呆等，因此尋找天然高效的抗氧化劑具有重要意義[21]。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)超聲波輔助提取的毛木耳黑色素體外化學(xué)抗氧化和細(xì)胞抗氧化活性進(jìn)行分析，體外化學(xué)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛木耳黑色素具有良好的抗氧化活性，超聲波輔助提取的毛木耳黑色素與非超聲組提取得到的黑色素抗氧化活性相近，說明超聲波不影響毛木耳黑色素的抗氧化活性，可以應(yīng)用于毛木耳黑色素的高效提取。體外細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛木耳黑色素預(yù)處理能夠明顯減輕由H2O2導(dǎo)致的L02細(xì)胞活力下降及其細(xì)胞形態(tài)的改變，且降低細(xì)胞內(nèi)ROS升高，說明毛木耳黑色素在體外對(duì)H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。該研究結(jié)果為毛木耳黑色素高效提取及其產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

圖7 毛木耳黑色素對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞形態(tài)及其活性氧含量的影響Fig.7 The effects of Auricularia polytricha melanin on H2O2-induced cell morphology and the content of reactive oxygen注：A.毛木耳黑色素(APM)對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞形態(tài)的改善作用；B.毛木耳黑色素(APM)對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的L02細(xì)胞活性氧含量的影響。Note:A.The improving effect of Auricularia polytricha melanin on cell morphology induced by H2O2;B.The effects of Auricularia polytricha melanin on the content of reactive oxygen species in L02 cells induced by H2O2.