附子水溶性生物堿含量測定與道地性相關分析

羅春梅，夏燕莉，黃志芳，湯依娜，劉云華，劉玉紅，陳 燕，易進海*

1四川省中醫藥科學院 中藥材品質及創新中藥研究四川省重點實驗室，成都 610041；2成都大學 藥學與生物工程學院，成都 610106

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品[1]，為臨床常用有毒中藥，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛等功效，被歷代醫家稱為“最難用亦最有用的藥材”[2,3]。附子主要種植在我國西南地區，主產區分布在四川江油、四川布拖、陜西漢中及云南等地，其中江油為公認的附子傳統道地產區，質量上乘，有長達1 300余年栽培歷史，具有成熟而獨特的栽培和加工技術[4]。為了滿足市場需求，其他非道地產區附子運往江油加工后作為江油附片混淆銷售，使江油附子的道地品牌和品質受到嚴重影響。目前，附子道地性的形成機制尚不清楚，市場上附片品種較多，質量參差不齊。因此，尋找區分道地產區附子與非道地產區附子的特征性差異成分，對附子及附片的質量進行有效控制成為亟待解決的問題。

現代藥理學研究表明，水溶性生物堿為附子的重要活性成分，具有強心[5-8]、抗心律失常、抗炎鎮痛、降壓等作用[9-12]。絕大部分水溶性生物堿不含紫外吸收基團，不能采用常規的HPLC-UV法進行檢測[13]。張定堃等[14]采用UPLC-Q-TOF-MS法分析出尼奧靈、宋果靈等7種可能為區分不同產地附子的差異成分，林俊芝等[15]也采用UPLC-Q-TOF/MS法證實尼奧林、附子靈等在江油附子中含量較高。本課題組預實驗結果證明，江油附子中尼奧靈含量的確明顯高于其他產區，故收集江油、陜西、布拖、云南四個產區42批泥附子，以及9批由江油附子炮制加工的生附片、蒸附片、炒附片，采用HPLC-ELSD法測定尼奧靈、附子靈及宋果靈3種主要水溶性生物堿的含量，進行水溶性生物堿含量與道地性的相關分析，為附子的道地性鑒別及附片的質量控制提供新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 1260 Infinity 蒸發光散射檢測器(美國Agilent公司)，MS205DU型十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)，Milli-Q Integral 3型超純水機(美國Millipore公司)，KQ-300超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，冷凍干燥機，ST16R型臺式冷凍離心機(Thermo Scientific公司)。

1.2 材料

附子靈(批號MUST-16032804)、尼奧靈(批號MUST-16052503)、宋果靈(批號MUST-16032515)，質量分數均≥98%(成都曼思特生物科技有限公司)，色譜純乙腈、甲醇(美國Fisher公司)，色譜純三乙胺(成都市科龍化工試劑廠)，其余試劑均為分析純。42批鮮附子采自四川江油、陜西漢中、四川布拖、云南，編號分別為JY 1～JY 10，SX 1～SX 8，BT 1～BT 13，YN 1～YN 11，江油附子炮制加工的生附片、蒸附片、炒附片購于四川江油中壩附子科技發展有限公司，編號分別為SFP 1～SFP 3，ZFP 1～ZFP 3，CFP 1～CFP3，由成都大學夏燕莉教授鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根，樣品信息來源見表1，不同產區附子圖片見圖1。

圖1 江油(A)、陜西(B)、布拖(C)、云南(D)產區泥附子外觀性狀Fig.1 Appearance of crude Fuzi from Jiangyou (A),Shaanxi (B),Butuo (C) and Yunnan (D)

表1 不同產區附子及附片信息

2 方法與結果

2.1 混合對照品儲備液的制備

取各對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液制成每1 mL含附子靈0.3 mg，尼奧靈0.35 mg，宋果靈0.15 mg的混合對照品儲備溶液。

2.2 供試品溶液的制備

42批鮮附子洗凈泥沙，晾干后切成薄片冷凍干燥，粉碎(過60目篩)備用。各批次附片粉碎，過60目篩備用。取上述附子和附片粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L鹽酸溶液25 mL，搖勻，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，搖勻，于8 000 rpm離心6 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件及系統適應性實驗

色譜柱：Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%(體積分數)三乙胺(B)，梯度洗脫(0～8 min，10%～20% A；8～15 min，20%～25% A；15～25 min，25%～25% A；25～30 min，25%～28% A；30～31 min，28%～50% A；31～38 min，50%～55% A；38～48 min，55%～90% A)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測器：蒸發光散射檢測器，以氮氣為載氣，蒸發溫度50 ℃，載氣流速1.2 L/min，增益為1；進樣量40～80 μL。在上述色譜條件下，混合對照品、附子及附片樣品的HPLC圖見圖2。

圖2 對照品(A)、江油附子(B)、陜西附子(C)、布拖附子(D)、云南附子(E)、生附片(F)、炒附片(G)及蒸附片(H)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A),crude Fuzi of Jiangyou(B),Shaanxi (C),Butuo(D) and Yunnan(E),Sheng Fupian(F),Chao Fupian(G) and Zheng Fupian(H)注：1.附子靈；2.尼奧靈；3.宋果靈。Note:1.fuziline;2.neoline;3.songorine.

2.4 線性與范圍、檢測限與定量限

分別精密吸取“2.1”項下混合對照品儲備液0.5、1、3、6、8、10 mL，分別置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。吸取上述混合對照品溶液20 μL，按“2.3”項下色譜條件測定色譜峰面積。以峰面積的對數值為縱坐標(Y)，對照品進樣量的對數值為橫坐標(X)，進行線性回歸分析，計算回歸方程和相關系數；將混合對照品溶液逐級稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比S/N為3∶1和S/N為10∶1確定檢測限和定量限，結果見表2。

表2 3種生物堿的線性與范圍、檢測限與定量限

2.5 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液(ZFP1)80 μL，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示，附子靈、尼奧靈、宋果靈的RSD分別為2.47%、2.84%、1.22%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取供試品溶液(ZFP1)，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣80 μL，按“2.3”項下色譜條件分析，附子靈、尼奧靈、宋果靈峰面積的RSD分別為2.11%、3.56%、3.85%，表明供試品溶液室溫放置24 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品(ZFP1)，精密稱取6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件分析，進樣80 μL，測得附子靈、尼奧靈、宋果靈含量的平均值(n=6)分別為0.308 6、0.832 5、0.252 9 mg/g，RSD分別為0.71%、2.54%、1.24%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品(ZFP1)6份，每份約0.5 g，精密加入混合對照品溶液適量，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣80 μL，照“2.3”項下的色譜條件進行含量測定，計算3種生物堿的平均回收率及RSD，結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果( n = 6)

2.9 樣品含量測定

各產區附子及附片按“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行2份，照“2.3”項下的色譜條件進行測定，計算3種水溶性生物堿的含量，結果見表4～8。四個產區附子及附片中3種生物堿的均值分布見圖3。從3種生物堿的總體分布趨勢來看(圖3A)，江油與陜西產區分布類似，而布拖則與云南產區相似。表4～7顯示四個產區附子中3種生物堿的分布明顯不同，其中附子靈、尼奧靈的含量差異較大，含量分別在230.2～2 407.2 μg/g，0～1 834.5 μg/g之間，尼奧靈在江油產區中含量最高，均值為1 352.6 μg/g，約為云南、布拖產區均值的3.5倍，明顯高于其他產區；而附子靈在云南產區中含量最高，均值為1 317.0 μg/g，約為江油、陜西產區均值的3.0倍。由此可見，尼奧靈可能為區分江油附子與其他非道地產區附子的特征性差異成分，其含量均大于880 μg/g。

生附片和炒附片中尼奧靈含量均大于1 500 μg/g，與江油泥附子中尼奧靈的含量相當，而蒸附片中尼奧靈含量約為生附片的一半，可能是由于附片蒸制過程中，尼奧靈隨水蒸汽冷凝而丟失。上述結果證明，江油附子炮制加工成附片，尼奧靈也是3種水溶性生物堿中含量最高的成分，其整體概貌與江油附子相似(圖3B)，且3種附片炮制品內部尼奧靈含量差異不大，質量穩定可控。因此，尼奧靈可作為區分江油生附片、炒附片、蒸附片與其他非道地產區附片的質量評價指標。

表4 江油附子中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

表5 陜西附子中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

表6 布拖附子中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

表7 云南附子中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

表8 9批附片中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

圖3 四個產區附子(A)和江油附片(B)中3種生物堿的均值分布Fig.3 The average content of three alkaloids from four regions (A) and Fupian of Jiangyou (B)

2.10 正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)

為找出區分江油附子與其他非道地產區附子的關鍵成分，將色譜分析數據導入SIMCA 11.0 軟件，以色譜峰的保留時間為變量ID，以樣品編號(江油附子設為一組，編號為JY，將其他3個產區附子設為一組，編號為QT)為觀察ID，構建OPLS-DA模型，OPLS-DA得分圖見圖4A，該模型的R2X=0.575，R2Y=0.902，Q2=0.646，表明該模型預測能力強。采用CV-ANOVA驗證模型的可靠性，P值等于1.064×10-5，表明模型穩定可靠。從圖4A可以看出，江油附子與其他產區附子分布區域明顯不同。各變量VIP值圖見圖4B，其中，26.686(尼奧靈)，25.324 min的峰對分類具有顯著影響(VIP值大于2.0)，表明尼奧靈為區分江油附子與其他產區附子的差異成分，這也印證了含量測定的分析結果，即江油附子中尼奧靈的含量顯著高于其他產區附子。

圖4 江油附子與其他產區附子的OPLS-DA得分圖(A)和VIP值圖(B)Fig.4 OPLS-DA score plot(A) and VIP plot(B) from the Fuzi of Jiangyou and other regions

3 結論

文獻報道附子雙酯型生物堿與其道地性相關[14-16]，但附子加工炮制后，雙酯型生物堿轉化為單酯型生物堿和原堿，使得不同產區附子中特征性差異成分雙酯型生物堿發生轉化，且附片成品中雙酯型生物堿含量很低。而水溶性生物堿尼奧靈、附子靈、宋果靈為附子的固有成分，不會因加工炮制由酯型生物堿轉化而來[17]，故本文考察附子水溶性生物堿與其道地性的相關性。

四個產區附子生長環境差異較大，江油海拔較低，氣候濕潤，降雨量充足，該地區附子中尼奧靈含量顯著高于其他產區(> 880 μg/g)，均值約為云南、布拖產區的3.5倍，而云南與布拖產區海拔較高，晝夜溫差大，光照充足，該地區附子中附子靈含量明顯高于其他產區，均值約為陜西、江油產區的3倍，提示生態環境與生物堿的累積密切相關。江油附子栽培技術規范，精細化種植需修根、打尖、摘芽，附子個頭較大，而陜西、云南附子種植方式粗獷，附子個頭較小。布拖附子分布區域廣，部分附子栽培較為規范，與江油附子種植方法相似，該部分附子個頭、外觀與江油附子相當，但尼奧靈含量(<700 μg/g)明顯低于江油附子，顯著不同。故推測尼奧靈含量的累積可能與江油獨特的地理環境密切相關，影響附子道地性的主要因素可能為地理環境。此外，陜西產區3種水溶性生物堿的分布規律與江油類似，但尼奧靈含量也明顯低于江油附子，約為江油附子的一半，且含量測定與OPLS-DA結果均證明尼奧靈為江油附子的差異性成分。因此，作者認為尼奧靈與附子道地性有相關性。

本文測定了江油附子炮制加工的蒸附片、炒附片以及生附片中3種水溶性生物堿的含量，結果同樣證明，附片中尼奧靈含量最高。由此可見，尼奧靈作附片質量控制的指標性成分，能夠實現將道地附片與非道地附片區分開來，破解非道地產區附子加工成附片，混淆江油附片銷售的難題。但是對于傳統炮制工藝加工的黑順片、白附片等，經過膽巴水浸泡、漂洗、蒸煮等處理，水溶性生物堿幾乎損失殆盡[17]，本文建立的測定方法還不能檢出其水溶性生物堿的含量，其測定方法有待進一步研究。現代藥理學研究表明，尼奧靈具有強心、抗炎鎮痛等藥理活性[8,9,11]。因此，尼奧靈作為附子及附片質量控制的一個評價指標能夠彰顯和弘揚江油附子的品牌、品質的優勢特色，為建立科學合理的附子道地性品質評價方法和質量控制標準提供參考。