香鱗毛蕨化學成分及其體外抗淺部真菌活性研究

梁玉婷，宋國強，林楚怡，劉小赟，潘敬靈，沈志濱

廣東藥科大學中藥學院，廣州 510006

香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott.屬于鱗毛蕨科鱗毛蕨屬落葉多年生草本植物，一般生長于樹林下或巖石縫里，主要分布于我國東北、華中、華北等地區[1]。根據民間驗方記載，香鱗毛蕨對皮膚病(牛皮癬、頭癬、干癬)具有很好的療效[2，3]，香鱗毛蕨的生物活性成分主要有間苯三酚類、萜類、黃酮類及苯丙素類等，具有抗菌、止癢、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理作用[4]。前期有文獻報道，香鱗毛蕨提取物中含有間苯三酚類衍生物的總量越高，其抗菌效果越好[5，6]。因此，為了更加全面了解香鱗毛蕨的抗菌化學成分，以便深度開發利用其藥用價值，本文對香鱗毛蕨提取分離，得到 8 個化合物，分別為白綿馬素PB(1)、綿馬素PP(2)、黃綿馬酸BB(3)、田基黃綿馬酸A(4)、filicinic acid VI(5)、mallophenone(6)、綿馬素AB(7)、綿馬酚B(8)，其中化合物1～6均為首次從該植物中分離得到，此外還經抗真菌篩選，發現這8個化合物均對紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌有一定的抑制作用，其中化合物3～8抑制效果較好，值得進一步深入研究，為開發新的抗菌藥物提供基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

自動提取濃縮機(EC-1500/VC-600，臺灣元成機械股份有限公司)； YMC-Pack R&D ODS-A 半制備型色譜柱(20 mm ×250 mm，5 μm，日本 YMC 公司)；離子阱質譜儀( LCQTM DECA，美國 Thermo-Finnigan公司)；美國Waters ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀(含QSM四溶劑管理器、SM-FTN樣品管理器、PDA二級管陣列檢測器及 Empower 3工作站)；半制備液相色譜儀(SPD-20A檢測器，LC-6AD型，日本島津公司)；超導脈沖傅里葉變換核磁共振儀(Varian UNITY INOVA 500，美國 Varian 公司)；暗箱式紫外分析儀(Zf20D，上海顧村電光儀器廠)；顯色加熱器(YOKO-XR，武漢藥科新技術開發公司)；X-5 顯微熔點測定儀(鞏義市科瑞儀器有限公司)；生物顯微鏡(XSP-10C，上海永享光學儀器制造有限公司)。

1.2 材料

柱層析硅膠(60～100 目、200～300 目)及薄層層析硅膠GF254(青島海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20型凝膠(Pharmacia公司)；固蘭BB鹽(上海化學試劑廠)；甲醇為色譜純；乙醇、石油醚、正己烷、丙酮、甲酸、乙酸乙酯，三氟乙酸等均為分析純；水為純凈水。

鹽酸特比萘芬(大連美倫生物技術有限公司，純度>98%)；氟康唑(壽光富康制藥有限公司，純度：99.4%)。

香鱗毛蕨采自黑龍江省五大連池，由哈爾濱商業大學藥學院張德連副教授鑒定為鱗毛蕨屬植物香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott.。標本(XLMJ20130406)存放于廣東藥科大學中藥學院標本室。

1.3 實驗菌株

紅色毛癬菌(CMCC(f)T1b)標準株，石膏樣小孢子菌(CMCC(F)M2C)標準株，質量控制(QC)株采用近平滑念珠菌(ATCC22019)標準株，均購于中國醫學科學院皮膚研究所。

1.4 提取與分離

將香鱗毛蕨干燥粗粉10千克用10倍體積50%乙醇回流提取三次，時間分別為2、1.5、1.5 h；減壓濃縮回收乙醇至無醇味得樣品水溶液，用稀鹽酸調節pH為2.4，靜置2 h，離心得到沉淀下來浸膏1.2 kg。將樣品用乙酸乙酯和甲醇溶解后，用硅膠(60～100 目)拌樣，進行硅膠色譜柱初步分離，依次采用不同比例的石油醚：丙酮(100∶1→70∶1→50∶1→30∶1→10∶1→1∶1，V/V)洗脫，并用薄層色譜(TLC)分析后合并，共得到6個流分Fr.1～6。取Fr.1樣品30 g，充分溶解于乙酸乙酯中，用硅膠(60～100目)適量拌樣后，進行硅膠(200～300目)柱色譜分離，石油醚-丙酮(200∶1→50∶1，V/V)梯度洗脫，TLC檢識后，合并相似流份，得到組分Fr.1.1和Fr.1.2；Fr.1.2反復經過硅膠柱色譜分離，石油醚-丙酮(200∶1→90∶1，V/V)洗脫，Sephadex LH-20凝膠純化，合并相同流份，再用制備液相色譜法(甲醇，V=8 mL/min)分離制備得到化合物1(40 mg)；取Fr.2樣品30 g，溶解于乙酸乙酯中，用硅膠柱色譜分離，石油醚-丙酮(100∶1→80∶1，V/V)梯度洗脫，TLC檢識合并相似流份，Sephadex LH-20凝膠純化后用制備液相色譜法(95%甲醇，V=8 mL/min)分離制備得到化合物2(27 mg)和化合物7(31 mg)；Fr.3樣品50 g，進行硅膠柱色譜分離，石油醚-丙酮(80∶1→50∶1，V/V)梯度洗脫，TLC檢識后合并相似流份，得到組分Fr.3.1和Fr.3.2；Fr.3.2反復經過硅膠柱色譜分離，石油醚-丙酮(80∶1→50∶1，V/V)洗脫，Sephadex LH-20凝膠純化，合并相同流份，重結晶后用制備液相色譜法(90%甲醇，V=8 mL/min)分離制備得到化合物3(21 mg)和化合物4(41 mg)。Fr.5樣品50 g，硅膠柱色譜分離，石油醚-丙酮(50∶1→10∶1，V/V)梯度洗脫，經TLC檢識，合并相同流份，再經Sephadex LH-20凝膠純化，最后用制備液相色譜法(65%甲醇，V=8 mL/min)分離制備，得到化合物5(85 mg)、化合物6(65 mg)和化合物8(45 mg)。

1.5 最小抑菌濃度(MIC)測定

抗真菌實驗的操作方法一般采用微量稀釋法[7]，按美國CLSI制定的M38-A2方案進行試驗，簡述如下：利用接種環在培養好的沙氏培養基(SDA)表面菌落刮下少許，使用無菌研磨器將菌絲研碎，在研磨器中加入約1 mL無菌生理鹽水使真菌懸浮在其中，調整濁度至0.5麥氏濁度，并用血細胞計數板計數孢子數量及短菌絲數。使菌液濃度為1×103至3×103CFU/mL之間，即用RPMI-1640液體培養基將0.5麥氏濁度菌液稀釋1 000倍，并以血細胞計數板計數為準，得接種菌液。用RPMI-1640液體培養基稀釋單體化合物1～8的貯備液至160 μg/mL于96孔板上的第1至第10列用RPMI-1640液體培養基進行橫向倍比稀釋，第11列為生長對照孔，不加入藥液，只加入100 μL RPMI-1640液體培養基；第12列為空白對照，加入200 μL RPMI-1640液體培養基。然后再于第1～11列各孔中加入100 μL接種菌液，且各孔中抗菌藥物貯備液溶劑濃度(V/V)低于1%，符合M27-A3規定。將96孔板置于35 ℃恒溫孵育7天，直接觀察，與生長對照孔比較，96孔板中無真菌生長的濃度為最小抑菌濃度(MIC)。各菌株按以上操作平行重復測定 4 次，計算 MIC 的幾何均數。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物1～8的結構式見圖1。

圖1 化合物1～8的結構圖Fig.1 The molecular structures of compound 1～8

化合物1白色針狀結晶(丙酮)，mp.134～136 ℃，UV(MeOH) λmax:262 nm，GF254硅膠薄層色譜分析，噴以0.3% 固藍BB鹽溶液105 ℃ 顯色為紅色，HR-ESI-MS:m/z445.184 4 [M-H]-；分子式為C24H30O8。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:3.32 (2H,s,H-1′′),3.22 (1H,t,J=7.5 Hz,H-8),1.70 (2H,m,H-9),1.01 (3H,t,J=7.5 Hz,H-10),1.47 (3H,brs,H-11),1.54 (3H,brs,H-12),3.15 (2H,q,J=7.5 Hz,H-8′),1.17 (3H,t,J=7.5 Hz,H-9′),1.47 (3H,brs,H-10′),1.54 (3H,brs,H-11′),12.3 (1H,s,4-OH),12.3 (1H,s,4-OH′)；13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:18.0 (C-1′′),110.7 (C-1),187.6 (C-2),108.0 (C-3),199.1 (C-4),44.2 (C-5),173.2 (C-6),207.1 (C-7),44.4 (C-8),18.1 (C-9),13.9 (C-10),24.1 (C-11),25.3 (C-12),110.7 (C-1′),187.6 (C-2′),108.0 (C-3′),198.6 (C-4′),44.2 (C-5′),173.2 (C-6′),206.2 (C-7′),34.7 (C-8′),8.4 (C-9′),24.1 (C-10′),25.2 (C-11′)。與文獻[8]對照，其波譜數據基本一致，故鑒定化合物1為白綿馬素PB。

化合物2淡黃色針狀結晶(石油醚)，mp.134～136 ℃ ，UV (MeOH) λmax:290 nm，硅膠薄層色譜分析，噴以0.3% 固藍BB鹽溶液105 ℃顯色為橙黃色， HR-ESI-MS:m/z433.637 0 [M+H]+；分子式為C23H28O8。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:3.73 (3H,s,H-7),3.20 (2H,q,J=7.5 Hz,H-9),1.21 (3H,t,J=7.5 Hz,H-10),2.14 (3H,brs,H-11),3.58 (2H,s,H-7′),3.1 (2H,q,J=7.5 Hz,H-9′ ),1.17 (3H,t,J=7.5 Hz,H-10′),1.46 (3H,brs,H-11′),1.53 (3H,brs,H-12′),15.6 (1H,s,4-OH),10.0 (1H,s,6-OH),11.5 (1H,s,4-OH′)；13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:112.6 (C-1),162.9 (C-2),107.6 (C-3),159.7 (C-4),109.6 (C-5),160.4 (C-6),61.6 (C-7),207.6 (C-8),35.7 (C-9),8.9 (C-10),9.4 (C-11),l11.1 (C-1′),l87.6 (C-2′),108.1 (C-3′),l98.2 (C-4′),44.3 (C-5′),172.0 (C-6′),17.3 (C-7′),207.5 (C-8′),35.0 (C-9′),8.4 (C-10′),24.9 (C-11′),25.1 (C-12′)。與文獻[9]對照，其波譜數據基本一致，故鑒定化合物2為綿馬素PP。

化合物3淡黃色針狀結晶(丙酮)，mp.134～136 ℃，UV (MeOH) λmax:292 nm，GF254硅膠薄層色譜分析，噴以0.3% 固藍BB鹽溶液105 ℃顯色為紅色， HR-ESI-MS:m/z447.187 6 [M+H]+；分子式為C24H30O8。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:2.15 (3H,s,H-1′′),3.17 (2H,q,J=7.5 Hz,H-8),1.72 (2H,m,H-10),1.02 (3H,t,J=7.5Hz,H-10),3.54 (2H,brs,H-7′),3.10 (2H,q,J=7.5 Hz,H-8′),1.71 (2H,m,H-9′),1.01 (3H,t,J=7.5 Hz,H-10′),1.44 (3H,brs,H-11′),1.53 (3H,brs,H-12′),10.0 (1H,s,6-OH),11.4 (1H,s,4-OH′)；13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:111.4 (C-1),160.1 (C-2),108.2 (C-3),161.7 (C-4),102.3 (C-5),156.4 (C-6),207.0 (C-7),45.9 (C-8),18.4 (C-9),14.2 (C-10),105.0 (C-1′),l87.7 (C-2′),108.4 (C-3′),l98.8 (C-4′),44.4 (C-5′),172.0 (C-6′),206.7 (C-7′),43.2 (C-8′),18.3 (C-9′),14.1 (C-10′),24.9 (C-11′),25.5 (C-12′),7.7 (C-1′′)。與文獻[10]對照，其波譜數據基本一致，故鑒定化合物3為黃綿馬酸BB。

化合物4淡黃色針狀結晶(丙酮)，mp.134～136 ℃，UV (MeOH) λmax:298 nm，GF254硅膠薄層色譜分析，噴以0.3% 固藍BB鹽溶液105 ℃顯色為紅色，HR-ESI-MS:m/z447.203 3 [M+H]+；分子式為C24H30O8。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:2.12 (3H,s,H-1′′),4.21 (1H,m,H-8),1.21 (3H,d,J=7.5 Hz,H-9),1.21 (3H,d,J=7.5 Hz,H-10),2.12 (3H,s,H-11),3.96 (1H,m,H-8′),1.20 (3H,d,J=7.5 Hz,H-9′),1.20 (3H,d,J=7.5 Hz,H-10′),1.44 (3H,brs,H-11′),1.53 (3H,brs,H-12′),16.1 (1H,s,4-OH),10.0 (1H,s,6-OH),11.5 (1H,s,4-OH′)；13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:105.1 (C-1),161.8 (C-2),107.3 (C-3),163.1 (C-4),102.3 (C-5),160.4 (C-1),211.0 (C-7),39.3 (C-8),19.5 (C-9),19.5 (C-10),105.1 (C-1′),l87.5 (C-2′),107.3 (C-3′),l99.5 (C-4′),44.5 (C-5′),171.9 (C-6′),203.7 (C-7′),36.9 (C-8′),19.4 (C-9′),19.4 (C-10′),24.9 (C-11′),25.1 (C-12′),7.7 (C-1′′)。與文獻[11]對照，其波譜數據基本一致，故鑒定化合物4為田基黃綿馬酸A。

化合物5白色針狀結晶(丙酮)，mp.134～136 ℃，UV (MeOH) λmax:333 nm，GF254硅膠薄層色譜分析，噴以0.3% 固藍BB鹽溶液105 ℃顯色為黃色，HR-ESI-MS:m/z237.112 9 [M+H]+；分子式為C13H18O4。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:1.84 (3H,s,H-7),3.93 (1H,m,H-9),1.11 (3H,d,J=7.5 Hz,H-10),1.10 (3H,d,J=7.5 Hz,H-11),1.35 (3H,brs,H-12),1.35 (3H,brs,H-13)；13C NMR (CDCl3,125MHz)δ:105.2 (C-1),190.9 (C-2),50.1 (C-3),176.9 (C-4),103.6 (C-5),198.9 (C-6),7.4 (C-7),209.5 (C-8),37.1 (C-9 ),19.5 (C-10),19.5 (C-11),25.1 (C-12),25.1 (C-13)。與文獻[12]對照，其波譜數據基本一致，故鑒定化合物5為Filicinic acid VI。

化合物6黃色針狀結晶(丙酮)，mp.155～156 ℃，UV (MeOH) λmax:290 nm，GF254硅膠薄層色譜分析，噴以0.3% 固藍BB鹽溶液，105 ℃顯色為橙黃色，HR-ESI-MS:m/z211.099 0 [M+H]+；分子式為C11H16O4。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:3.72 (3H,s,H-7),2.70 (3H,s,H-9),2.13 (3H,s,H-10),2.10 (3H,s,H-11)；13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:110.5 (C-1),163.1 (C-2),109.9 (C-3),160.7 (C-4),107.9 (C-5),160.7 (C-6),63.2 (C-7),205.2 (C-8),32.8 (C-9),10.1 (C-10),9.0 (C-11)。與文獻[13]對照，其波譜數據基本一致，故鑒定化合物6為Mallophenone。

化合物7黃色針狀結晶(丙酮)，mp.118～120 ℃，UV (MeOH) λmax:350 nm，硅膠薄層色譜分析，噴以0.3% 固藍BB鹽溶液105 ℃顯色為橙黃色， HR-ESI-MS:m/z433.634 9[M+H]+；分子式為C23H28O8。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:3.73 (3H,s,H-7),3.10 (2H,t,J=7.5 Hz,H-9),1.73 (2H,m,H-10),0.99 (3H,t,J=7.5 Hz,H-11),2.14 (3H,brs,H-12),3.58 (2H,s,H-7′),2.7 (3H,s,H-9′),1.46 (3H,brs,H-10′),1.53 (3H,brs,H-11′),15.6 (1H,s,2-OH),10.0 (1H,s,6-OH),11.4 (1H,s,4-OH′),18.4 (1H,s,6-OH′)；13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:112.6 (C-1),162.9 (C-2 ),107.7 (C-3),159.8 (C-4),109.6 (C-5),160.4 (C-6),61.7 (C-7),207.0 (C-8),44.5 (C-9),18.3 (C-10),14.1 (C-11),9.4 (C-12),l11.1 (C-1′),l87.6 (C-2′),108.6 (C-3′),l98.9 (C-4′),44.4 (C-5′),172.2 (C-6′),17.3 (C-7′),203.7 (C-8′),29.5 (C-9′),24.9 (C-10′),25.1 (C-11′)。與文獻[9]對照，其波譜數據基本一致，故鑒定化合物7為綿馬素AB。

化合物8黃色針狀結晶(丙酮)，mp.144～145 ℃，UV (MeOH) λmax:287 nm，硅膠薄層色譜分析，噴以0.3% 固藍BB鹽溶液105 ℃顯色為淺紫色，HR-ESI-MS:m/z225.112 9 [M+H]+；分子式為C12H16O4。1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:5.98 (1H,s,H-5),3.80 (3H,s,H-7),3.03 (2H,t,J=7.5 Hz,H-9),1.68 (2H,m,H-10),0.96 (3H,t,J=7.5 Hz,H-11),1.90 (3H,s,H-12)；13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:105.8 (C-1),165.1 (C-2),104.7 (C-3),162.0 (C-4),91.0 (C-5),163.8 (C-6),56.0 (C-7),207.9 (C-8),47.2 (C-9),19.5 (C-10),14.5 (C-11),7.4 (C-12)。與文獻[14]對照，其波譜數據基本一致，故鑒定化合物8為綿馬酚B。

2.2 體外抗真菌活性評價

在每次測定MIC時必須進行質量控制，本試驗采用近平滑念珠菌(ATCC 22019)作為質控(QC)株，以氟康唑為QC藥物。在平行操作條件下，QC株的MIC應在1.0～4.0 μg/mL 范圍內，方可視為測定結果有效可信。

結果QC株的MIC為1.250 μg/mL，各受試藥物及陽性藥物(鹽酸特比萘芬)體外抗真菌活性測定見表1。

表1 各化合物對供試菌的MIC值

3 結論

根據文獻報道間苯三酚類衍生物對常見皮膚癬菌(紅色毛癬菌，須癬毛癬菌和石膏樣小孢子菌等)有很好的抑制作用[15]。本課題組前期研究發現甲基間苯三酚的羥基為活性基團，并且C-4位或者C-6位為活潑位點，在此位置引入不同的基團可使得化合物性質或者生物活性發生改變，以甲基間苯三酚為基礎，引入丁酰基比引入烷基化合物抗菌作用強[16]。

本研究從香鱗毛蕨中分離得到的8個間苯三酚類衍生物，其母核結構類似，母核結構式如圖2。化合物3、4和7由甲基間苯三酚和綿馬次酸母核組成，且當R1和R3為酰基時，其抗真菌活性為化合物4(R1=R3為異丁酰基)> 化合物3(R1=R3為丁酰基)> 化合物7(R1為丁酰基，R3為乙酰基)；化合物6和8以間苯三酚為母核，對真菌抑制作用為化合物8(R1為丁酰基)> 化合物6(R1為乙酰基，R2為甲基)，其他化合物有待進一步研究。后續亦可探索其對紅色毛癬菌及石膏樣小孢子菌的抗菌機制，可為進一步開發成新的抗菌藥物奠定基礎。

圖2 甲基間苯三酚母核及綿馬次酸母核結構式Fig.2 Structures of methyl-phloroglucinol and filicinic acid