曼氏無針烏賊纏卵腺抗菌糖蛋白提取工藝優化

陳淑敏，張玉琦，龔芳芳，王 曄，劉英丹，孟天宇，婁永江，李勇勇

寧波大學食品與藥學學院，寧波 315211

曼氏無針烏賊纏卵腺位于墨囊兩側，俗稱“烏賊蛋”、“墨斗卵”、“目蛋”，不僅被視為海味珍品，具有補腎填精、開胃利水之功效，而且含有豐富的糖蛋白[1]。糖蛋白是一類由糖類同蛋白質或多肽共價連接而成的結合蛋白。近年來，天然糖蛋白由于具有多種生物活性被廣泛應用于食品科學、藥學、生物工程學等領域。目前，糖蛋白的研究多集中在植物和菌類糖蛋白方面，隨著海洋生物研究的深入，海洋動物及其加工副產物(纏卵腺、內臟、精巢)中糖蛋白的生物活性引起了人們的廣泛關注。研究表明，從海蜇[2]、蛤蜊[3]、大鯢粘液[4]、海馬[5]、牡蠣[6,7]、扇貝[8,9]、魷魚內臟[10]、和魷魚纏卵腺[11]等中提取的糖蛋白具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、調節免疫力等生物活性。此外，研究發現從海兔的卵中分離純化出的糖蛋白具有抗菌活性[12]。但是對烏賊蛋糖蛋白及其生物活性研究甚少，特別是對其抗菌活性方面尚未有研究。

本文采用堿法提取，優化了抗菌糖蛋白的提取工藝，同時采用陰離子交換柱(DEAE-52)對糖蛋白進行分離純化。考察了其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性，并與常見防腐劑山梨酸鉀的抗菌活性作比較，為烏賊纏卵腺糖蛋白防腐保鮮方面的運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設備

原料：東海捕撈曼氏無針烏賊，冰水中解剖取其纏卵腺，清洗，除去外層薄膜后分裝，迅速凍藏于-80 ℃，保存備用。

菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

試劑：氫氧化鈉、無水乙醇、氯化鈉、山梨酸鉀、葡萄糖、苯酚、牛血清蛋白、PBS、DEAE-52、濃硫酸等，均為分析純。

主要儀器設備：臺式高速冷凍離心機，德國Thermo Scientific公司；冷凍干燥機，美國Labconco公司；UV-1800APC雙光束紫外/可見分光光度計，上海美析儀器有限公司；旋轉蒸發器RE-52A，上海亞榮生化儀器廠；XHF-D型內切式勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；蘇州凈化雙人單面凈化工作臺SW-CJ-2FD；DYY-6D型電泳儀電源，北京六一生物科技有限公司；超聲波清洗機，南京賽飛生物科技有限公司；電熱恒溫培養箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠。

1.2 糖蛋白提取工藝

1.2.1 提取工藝流程

準確稱取1 g曼氏無針烏賊纏卵腺，去除外層薄膜，洗凈，剪碎，分別加入一定量的NaOH溶液8 000 rpm勻漿1 min，在不同的溫度，時間條件下超聲輔助提取，9 000 rpm離心10 min，取上清液，加入無水乙醇使其在溶液中的濃度為50%，除出淀粉等雜質，離心取上清液，再加入無水乙醇使其在溶液中的濃度為75%，醇沉4 h，放入透析袋中透析48 h，冷凍干燥得糖蛋白粗品。

1.2.2 單因素試驗

以粗糖蛋白得率為指標，準確稱取1 g曼氏無針烏賊纏卵腺，分別加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L的 NaOH溶液，8 000 rpm勻漿1 min，在恒定條件(超聲溫度25 ℃，超聲時間為2.5 h,超聲功率為200 W，液料比為30∶1)下超聲輔助提取，考察不同濃度的NaOH溶液對糖蛋白得率的影響；根據上述方法固定其他因素，分別選擇提取溫度(4、15、25、35、45 ℃)、時間(0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 h)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)依次設計單因素試驗，以考察不同因素對糖蛋白得率的影響，獲得超聲輔助提取糖蛋白的優化工藝條件。

1.2.3 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，選取NaOH濃度、超聲溫度、超聲時間三個因素對其進行優化試驗。利用 Design Expert.8.0.5 軟件處理數據，采用 Box-Behnken進行響應面設計，對實驗結果進行回歸擬合分析

1.2.4 糖蛋白分離純化

以DEAE-52纖維素作為柱填料，將粗糖蛋白樣品溶解在緩沖液中(pH 7.4的PBS)，微膜(孔徑0.22 μm)過濾后上樣，用0.5、1 mol/L NaCl溶液作為洗脫溶劑，洗脫速度為1 mL/min，每3 min記錄洗脫液在280和490 nm(苯酚-硫酸比色法[13])的吸光度，并記錄。

1.3 抗菌活性的測定

1.3.1 菌懸液制備

在超凈工作臺中，將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種到LB瓊脂斜面上，置于37 ℃培養箱中培養24 h，得到活化的菌落，取適量菌落放于盛有無菌生理鹽水的試管中，將菌懸液的濃度控制在10-7～10-8CFU/mL，制備好的細菌懸浮液密封，4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 含菌平板制備

無菌環境下，將滅菌后的LB瓊脂培養基放置至溫度約為50 ℃，倒入無菌的培養皿內，待平板內瓊脂凝固后，取各供試菌菌懸液100 μL涂布均勻，制成含菌平板。

1.3.3 抑菌效果及最小抑菌濃度測定

1.3.3.1 抑菌效果測定

采用牛津杯法，將滅菌后的牛津杯(內徑直徑為6 mm)用無菌鑷子取出放在含菌平板上，分別在每個牛津杯中加入100 μL純化后的糖蛋白溶液，無菌水作對照，做好標記，置于恒溫培養箱中(37 ℃)中培養24 h，做三個重復試驗。用電子游標卡尺測量抑菌圈直徑。結果取各次測定的平均值。

1.3.3.2 最小抑菌濃度測定

對純化后有抑菌活性的組分進行最小抑菌濃度測定，用無菌鑷子取出牛津杯，放在無菌平板上，將質量濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的糖蛋白溶液100 μL加入牛津杯里，設置三個平行實驗，同時做空白對照。在恒溫培養箱中(37 ℃)中培養24 h，用電子游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.4 SDS-PAGE電泳鑒定

參照徐偉良[14]的方法適當調整，分離膠、濃縮膠濃度選用12%和5%，15 μL上樣，起始電壓80 V，待樣品跑過濃縮膠后調到120 V至樣品電泳到膠底部為止。用考馬斯亮藍蛋白快速染色液染色，脫色后觀察電泳條帶。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 NaOH濃度對糖蛋白得率的影響

由圖1可知，NaOH濃度對糖蛋白的得率是有影響的。當NaOH濃度較低時，糖蛋白富集程度較低，得率較低。濃度較高時，高濃度的堿破壞了糖蛋白結構，導致糖鏈斷裂[15]，另外，高濃度的堿可使蛋白質降解變質[16]，從而使糖蛋白得率下降。

圖1 NaOH濃度對糖蛋白得率的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on the extraction yield of glycoprotein

2.1.2 提取溫度對糖蛋白得率的影響

由圖2可知，提取溫度對糖蛋白的得率是有影響的。溫度較低時，糖蛋白溶出率不高，得率較低，溫度較高時，會導致糖和蛋白的結合斷裂并破壞蛋白結構[15]，從而使糖蛋白得率下降。

圖2 提取溫度對糖蛋白得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of glycoprotein

2.1.3 提取時間對糖蛋白得率的影響

由圖3可知，提取時間對糖蛋白的得率是有影響的，提取時間較短時，糖蛋白無法達到充分富集的效果[17]，提取時間過長會引起目標糖蛋白糖苷鍵斷裂，導致其降解。從而導致糖蛋白得率下降。

圖3 提取時間對糖蛋白得率的影響Fig.3 Effect of different time on the extraction yield of glycoprotein

圖4 液料比對糖蛋白得率的影響Fig.4 Effect of ratio of water/material on the extraction yield of glycoprotein

2.1.4 液料比對糖蛋白得率的影響

由圖4可知，液料比較低時，浸提液中NaOH含量相對較低，使得糖蛋白無法充分富集[15]。液料比較高時，糖蛋白得率無明顯變化，并且浸提液過多時，糖蛋白不易收集。綜合考慮，不對液料比進行響應面優化研究。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面分析方案及試驗結果

根據單因素試驗結果，響應面試驗因素水平及編碼如表1所示，響應面試驗結果如表2所示。

表1 響應面試驗設計因素水平表

2.2.2 二次回歸模型擬合及方差分析

利用Design Expert.8軟件對表2試驗數據進行回歸分析，獲得回歸模型方差分析及顯著性結果如表3所示。

表2 響應面試驗結果

表3 回歸模型方差分析及顯著性結果

注：**差異高度顯著(0.0001

Note:**indicates extremely significant difference;*indicates significant difference.

利用Design Expert.8軟件進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程為：Y=8.31+0.21×A+0.55×B+0.36×C-0.15×A×B+0.094×A×C-0.34×B×C-0.78A2-1.17B2-0.47C2，由方差分析可以看出：模型P<0.01，表明該回歸模型高度顯著；失擬項P>0.05，說明該模型擬合度好。各交互作用對糖蛋白得率的影響結果如圖5所示。

圖5 各交互作用對糖蛋白得率影響的響應面圖Fig.5 Response surfaces graphs showing the extraction yield of glycoprotein between the various factors and interaction effect

2.2.3 響應面分析與最優條件的確定

經過優化后，得到的最佳提取工藝參數為NaOH濃度為0.43 mol/L，提取時間2.83 h、提取溫度26.8 ℃。此時糖蛋白得率預測值為8.42%。為方便實際操作，修正工藝參數NaOH濃度為0.43 mol/L、提取時間2.8 h、提取溫度27 ℃。經過三次重復性實驗驗證，糖蛋白實際得率為8.31%±0.18%，與實驗預測值誤差僅為0.12%。章建設等[10]采用鹽溶液浸提法提取魷魚內臟中的糖蛋白，最高得率僅為2.24%。說明堿法提取糖蛋白效果較好。

2.3 糖蛋白DEAE-52柱層析結果

經堿法提取出的糖蛋白粗品是糖和蛋白的復合物，為分析哪一部分具有抗菌活性，對糖蛋白粗品進行分離純化。如圖6所示，將凍干的糖蛋白粗品經DEAE-52離子交換層析柱層析，用0.5、1 mol/L 的NaCl溶液洗脫分別檢測蛋白和糖的含量，得出流出曲線。經層析柱分離，每隔3 min收集流出液，在吸光度為280和490 nm處檢測糖蛋白含量，發現有三個組分(兩組重疊峰)，進行抗菌試驗。

圖6 DEAE-52柱層析分離圖譜Fig.6 DEAE-52 column chromatography separation map

2.4 糖蛋白抑菌活性及最小抑菌濃度結果分析

對分離得到的三個組分與山梨酸鉀進行抑菌效果比較，由圖7可知，組分1對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌幾乎沒有抑菌作用，組分2與組分3的抑菌效果明顯要強于同濃度山梨酸鉀的抑菌效果(P<0.01)，測定組分2與組分3對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度，從表4中可以看出，兩組分對大腸桿菌的最小抑菌濃度為20 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為30 μg/mL。

研究發現，大多數糖蛋白都具有抑菌活性，單媛媛[18]等從雞蛋蛋清中發現一種糖蛋白對大腸桿菌具有顯著的抑菌效果，最小抑菌濃度達50 μg/mL，Ebran等[19]從魚類表皮黏液中發現的糖蛋白對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也具有顯著的抑菌效果。測定其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為100、50 μg/mL。最小抑菌濃度值越小，說明抑菌效果越好，本實驗中的兩組分濃度在30 μg/mL左右時就表現出了顯著的抑菌活性，表明曼氏無針烏賊纏卵腺糖蛋白抗菌活性較強，具有廣譜的抑菌性，可見曼氏無針烏賊纏卵腺糖蛋白可作為動物源生物防腐劑代替化學防腐劑，在生物防腐方面具有較強的開發價值。

山梨酸鉀主要是通過抑制微生物體內的脫氫酶系統，從而抑制微生物生長。對比發現，曼氏無針烏賊纏卵腺糖蛋白相比山梨酸鉀具有更強的抑菌性，一方面可能是曼氏無針烏賊纏卵腺糖蛋白對微生物體內的脫氫酶系統抑制性更強，另一方面可能是糖蛋白能識別細菌細胞壁表面上的糖鏈和肽聚糖，從而導致細胞壁破壁，改變其通透性。此外，糖蛋白有可能抑制了細菌的核酸合成，使其新陳代謝受到干擾，從而達到抑菌效果[12,20]。

圖7 糖蛋白各組分與山梨酸鉀對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果比較Fig.7 Comparison of the antibacterial effect of glycoprotein components and potassium sorbate on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

表4 糖蛋白各組分對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度測定結果

注：“-”表示無抑菌圈產生。

Note:“-” Indicates no inhibition zone diameter.

2.5 SDS-PAGE電泳結果

圖8 SDS-PAGE電泳圖Fig.8 SDS-PAGE Electrophoresis注：M：蛋白Marker；A：組分2；B：組分3。Note:M:Protein Marker;A:component 2;B:component 3.

由圖8可見，組分2與組分3經SDS-PAGE后得到單一條帶，根據條帶顯示組分2中的活性蛋白分子量約為70 kDa，組分3的活性蛋白分子量約為33 kDa，初步證明組分2與組分3中的活性蛋白成分是由一種蛋白構成。

3 結論

本試驗在單因素的試驗基礎上，利用響應面分析法優化了超聲輔助提取抗菌糖蛋白的工藝條件。得出最佳工藝條件為：NaOH濃度為0.43 mol/L、提取時間2.8 h、提取溫度27 ℃，液料比30∶1，經過三次重復性實驗驗證，糖蛋白實際得率為8.31%±0.18%，與實驗預測值接近，說明該模型對優化曼氏無針烏賊纏卵腺抗菌糖蛋白提取工藝具有可行性。對最優工藝下的提取物經DEAE-52離子交換柱層析分離純化獲得3個組分。除組分1外，組分2與組分3對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌效果(P<0.01)，且其中的活性蛋白成分是一種蛋白構成。組分2與組分3的抑菌效果明顯要強于山梨酸鉀(P<0.01)，可見糖蛋白對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有強烈的抑菌作用，具有廣譜性。因此曼氏無針烏賊纏卵腺糖蛋白可作為一種生物防腐劑，在生物防腐的開發上有很強的商業價值。