4種竹葉營養成分分析及其黃酮提取物體外抗氧化活性研究

歐陽吾樂，雷福紅，楊亞晉，劉莉莉，李青青，郭愛偉*

1西南林業大學生命科學學院；2云南省高校林木生物技術重點實驗室，昆明 650224

竹子是禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoideae)多年生常綠植物，全世界記載的竹子約有60屬1 200多種，廣泛分布于東南亞、印度、中國、日本和南美等地[1]。我國約有30屬300余種[2]，而云南有“竹類故鄉”之譽，是公認的竹類植物的起源地和現代分布中心之一，有29屬220種，特有種在100種以上[3]。竹葉具有一定的藥用功效，中國古代許多藥典都記載了竹子的藥用價值，在《中華本草》中收錄了紫竹(Phyllostachysnigra)、淡竹 (Phyllostachysglauca)、苦竹(Pleioblastusamarus)、毛竹(Phyllostachysheterocycla)、慈竹(Neosinocalamusaffinis)、刺竹(BambusablumeanaSchult.f)和桂竹(Phyllostachysbambusoides)等竹，竹葉具有清熱除煩、消痰、止咳、健脾、生津利尿等功效，主治熱病、煩渴、小兒驚癇、舌瘡等[4]。近年來竹子植物化學方面的研究表明，竹葉中含有許多天然活性成分如黃酮類、生物堿、有機酸、萜類、酚類、蒽醌、鞣質、皂甙、多糖等化合物[5]，其中黃酮類化合物是竹葉中重要的活性物質，竹葉中黃酮含量較高的有麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)為2.02%，毛金竹(Phyllostachysnigra)為1.98%，毛竹為1.70%，高節竹(Phyllostachysprominens)為1.55%，較低的有四季竹(Oligostachyumlubricum)(1.18%)和苦竹(1.35%)等[6]。黃酮類化合物由于其結構中酚羥基內鄰位酚羥基極易被氧化，因此對活性氧和活性氮等自由基具有很強的捕捉能力，其具有較強的抗氧化功效[7,8]。

我國約有竹林面積 500多萬hm2，以每0.07 hm2產200 kg 鮮葉計算，若能利用其中1%用于天然抗氧化劑的開發，每年就可以提供14萬t原料，具有廣闊的開發前景[1]。本研究以西南林業大學竹園中的4種竹為研究對象，對其竹葉進行營養成分和黃酮分析，并提取了4種竹葉的黃酮提取物，在體外研究了4種竹葉黃酮提取物的抗氧化活性，為竹類資源中天然活性產物的開發利用提供理論依據，對竹葉的綜合利用具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 竹葉采集及制備

研究所用竹子來源于西南林業大學竹園，采集莿竹屬的觀音竹(Bambusamultiplex)，剛竹屬的金竹(Phyllostachyssulphurea)和紫竹(Phyllostachysnigra)，慈竹屬的孖竹(Neosinocalamusrecto-cuneatus)，采集每種竹的上、中、下三個部位葉子各500 g左右，將新鮮樣品滅活(120 ℃烘箱，10～15 min)后在實驗室陰干、粉碎，然后將每種竹葉的上、中、下三個部位的竹葉混勻，放置于-20 ℃儲藏備用[9]。

1.2 儀器與試劑

RV8 S96旋轉蒸發儀(德國IKA)，SG8200HPT超聲波清洗器(上海冠特)， M6纖維測定儀(丹麥福斯)，KJELTEC-2300全自動蛋白測定儀(丹麥福斯)，SZF-06A脂肪測定儀(上海新嘉)，TU-1901紫外可見分光光度計(北京普析)。所用試劑均為分析純。

1.3 竹葉營養成分測定

竹葉營養成分的測定參考Zhang[10]的《飼料分析及飼料質量檢測技術》中的方法和步驟，用凱氏定氮法測定粗蛋白(crude protein,CP)，索氏抽提法測定粗脂肪(ether extract,EE)，高溫灼燒法測定粗灰分(Ash)，粗纖維(crude fiber,CF)采用酸堿洗滌法測定，高錳酸鉀法測定鈣(calcium,Ca)，鉬黃比色法測定總磷(total phosphorus,TP)，無氮浸出物(nitrogen free extract,NFE)采用差值計算法計算[10]。

1.4 竹葉黃酮的提取及黃酮含量測定

竹葉黃酮提取方法參照Wang等的[11]方法，稱取1 g竹葉粉置于250 mL錐形瓶，與15 mL 70%乙醇充分混勻放入超聲波清洗器，在功率設30 W，提取25 min，提取3次，合并提取液抽濾，離心(4 ℃、8 000 rpm、10 min)，收集上清液轉移至旋轉蒸發儀濃縮 (45±1)℃至浸膏狀備用。以蘆丁為對照品，紫外分光光度計法測定總黃酮含量[11]。標準曲線的回歸方程：Y= 1.338x+ 0.000 4，R2= 0.999，Y為吸光度(Abs)，x為標樣濃度 (mg/mL)，說明蘆丁濃度C(mg/mL)與吸光度Abs之間具有良好的線性關系。

1.5 竹葉黃酮提取物的體外抗氧化研究

1.5.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照Zhang等[12]方法進行，準確稱取30.90 mg DPPH溶于250 mL棕色容量瓶中，用純水將竹葉黃酮提取物稀釋成質量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL，取1 mL不同濃度的竹葉黃酮提取物與1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于5 mL離心管中，搖勻后立即置于黑暗中反應1 h。用無水乙醇校零，在波長517 nm處測定吸光值為Abs樣本。重復以上操作，將樣本換成無水乙醇并測定吸光值為Abs空白，用BHT(二丁基羥基甲苯)作陽性對照實驗。DPPH自由基清除率計算如下:

SCDPPH(%) = (1-Abs樣本/Abs空白) × 100%

1.5.2 ABTS自由基清除方法

ABTS自由基清除實驗方法參照Li等[13]的方法進行，竹葉黃酮提取物用純水稀釋成質量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL溶液，取0.4 mL不同濃度的竹葉黃酮提取物與4 mL ABTS工作液混合后用旋渦混勻器振搖12 s，靜置300 s后用95%乙醇校零，在波長734 nm處測定吸光值并記作Abs樣本，然后將樣本換成95%乙醇重復上面的實驗步驟，測得吸光值記作Abs空白，以BHT作為陽性對照。ABTS自由基清除率計算公式如下：

SCABTS(%) = (Abs空白- Abs樣本) /Abs空白×100%

1.5.3 金屬螯合能力的測定

金屬螯合能力(metal-ion chelating activity)參照Wang等[14]的方法進行，用純水將竹葉黃酮提取物稀釋成質量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL，取0.5 mL不同濃度的竹葉黃酮提取物，依次加入1.8 mL甲醇、0.05 mL 2 mmol四水氯化亞鐵、0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪，混合均勻避光反應10 min，甲醇校零，在波長562 nm處測定樣品的吸光值為Abs樣本，空白對照吸光值記作Abs空白，以乙二胺四乙酸(EDTA)作陽性對照。金屬螯合能力計算公式如下：

金屬螯合能力 (%) = (1-Abs樣本/Abs空白) × 100%

1.5.4 亞鐵還原能力測定

亞鐵還原能力(ferric reducing antioxidant power，FRAP)測定參照Muller等[15]的方法進行。用純水將竹葉黃酮提取物稀釋成質量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mg/mL、0.50 mg/mL，將0.5 mL 竹葉黃酮提取物和1 mL的FRAP工作液混合，定容至10 mL，所得藍色溶液在室溫靜置20 min，測定593 nm處的吸光值，結果記為A593，1 mL FRAP試劑用雙蒸水定容至10 mL并測定吸光值作為空白，以BHT作為陽性對照。

1.6 數據處理

竹葉中營養成分用干物質(dry matter)表示，每份樣品均進行3次平行測定，取3次測定值的平均值作為該指標測定的結果。數據用SPSS 20.0進行統計分析，采用單因素方差分析，結果用平均值±標準差(mean±SD)表示，P< 0.05表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 4種竹葉營養成分和總黃酮分析

竹葉營養成分和黃酮的分析表明(表1)，4種竹葉的CP差異顯著(P<0.05)，孖竹葉CP最高(20.74±0.45)%，觀音竹CP最低(14.21±0.35)%；從EE來看，觀音竹 EE最高(2.92±0.08)%，孖竹EE最低(1.65±0.10)%，EE孖竹與觀音竹、紫竹、金竹間差異顯著(P<0.05)；4種竹葉中金竹Ash最高(13.6±0.45)%，孖竹最低(7.00±0.23)%；觀音竹、紫竹、金竹、孖竹間的Ash差異顯著(P<0.05)；CF觀音竹最高(28.77± 0.34)%，孖竹(22.19±0.40)% 最低，金竹和紫竹的CF無顯著性差異(P>0.05)；4種竹葉中NFE孖竹最高，觀音竹、紫竹、金竹無顯著差異(P>0.05)；4種竹葉中Ca差異顯著(P<0.05)，金竹Ca最高，觀音竹最低；4種竹葉TP在(0.12±0.01)% ～(0.15±0.02)%，無顯著性差異(P>0.05)；觀音竹中黃酮含量最高(1.90±0.25)%，其次為紫竹(1.43±0.12)%，金竹最低(0.37±0.02)%。

表1 4種竹子竹葉營養成分與黃酮分析(%)

注：同列中相同英文字母表示差異性不顯著(P> 0.05)，不同英文字母表示差異性顯著(P< 0.05)。

Note:The same letters in the same column mean no significant difference (P> 0.05),and different letters indicate significant difference (P< 0.05).

2.2 4種竹葉黃酮提取物的體外抗氧化研究

2.2.1 DPPH自由基清除能力

4種竹葉黃酮提取物對DPPH自由基清除的分析可以看出(圖1)，隨著竹葉黃酮提取物濃度的升高，4種竹葉黃酮提取物和BHT清除DPPH自由基能力也隨之增強，當濃度為0.15 mg/mL時，觀音竹黃酮提取物(BMLFE)、紫竹黃酮提取物(PNLFE)、孖竹黃酮提取物(NRLFE)、金竹黃酮提取物(PSLFE)和BHT對DPPH自由基的清除率分別為98.00%、80.88%、71.85%、97.87%及93.60%。總體上來看，4種竹葉中PSLFE清除DPPH自由基的效果最好，BMLFE清除DPPH自由基的效果與BHT接近。

圖1 4種竹葉黃酮提取物對DPPH自由基清除Fig.1 DPPH radical scavenging ability of flavonoid extracts from four bamboo leaves注：BMLFE為觀音竹黃酮提取物;PNLFE為紫竹黃酮提取物;NRLFE為孖竹黃酮提取物;PSLFE為金竹黃酮提取物;BHT為二丁基羥基甲苯。下同。Note:The BMLFE is flavonoid extracts from Bambusa multiplex leaves;The PNLFE is flavonoid extracts from Phyllostachys nigra leaves;The NRLFE is flavonoid extracts from Neosinocalamus recto-cuneatus leaves;The PSLFE is flavonoid extracts from Phyllostachys sulphurea leaves;BHT is butylated hydroxytoluene.The same as below.

2.2.2 ABTS自由基清除能力

竹葉黃酮提取物對ABTS自由基清除能力的分析可以看出(圖2)，隨著黃酮濃度的升高，竹葉黃酮提取物和BHT清除ABTS自由基能力也隨之增強，當濃度為0.15 mg/mL時，BMLFE、PNLFE、NRLFE、PSLFE和BHT對ABTS自由基的清除率分別為53.18%、52.76%、80.37%、74.11%及90.10%。總體上來看，對ABTS自由基的清除能力大小順序依次為BHT > NRLFE > PSLFE > PNLFE > BMLFE，4種竹葉中NRLFE和PSLFE清除ABTS自由基的效果與BHT接近，PNLFE和BMLFE清除效果較差。

圖2 4種竹葉黃酮提取物的ABTS自由基清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging ability of flavonoid extracts from four bamboo leaves

2.2.3 亞鐵還原能力

亞鐵還原能力的分析可以看出(見圖3)，隨著4種竹葉提取物和BHT濃度的增加亞鐵還原能力也逐漸增強，當濃度為0.5 mg/mL時，BMLFE、PNLFE、NRLFE、PSLFE和BHT的吸光值分別為0.50、0.49、0.45、0.53和0.25。總體上看，4種竹葉黃酮提取物的亞鐵還原能力均比BHT強，4種竹葉中PSLFE亞鐵還原能力最強，NRLFE最弱。

圖3 4種竹葉黃酮提取物的亞鐵還原能力Fig.3 The power of ferric reducing antioxidant of flavonoid extracts from four bamboo leaves

2.2.4 金屬螯合能力

一些金屬離子在脂質的氧化過程中起催化作用，并誘導自由基和脂質過氧化物的產生，因此具有金屬螯合作用的天然產物能間接地起到抗氧化作用。金屬螯合能力的分析可以看出(見圖4)，4種竹葉提取物和EDTA的金屬螯合能力隨黃酮濃度的升高而增強，但竹葉黃酮提取物金屬螯合能力明顯弱于EDTA。在濃度為0.5 mg/mL時，PSLFE與NRLFE金屬螯合能力較強，BMLFE最弱。

圖4 4種竹葉黃酮提取物的金屬螯合能力Fig.4 The metal-ion chelating activity of flavonoid extracts from four bamboo leaves

2.3 4種竹葉黃酮提取物的IC50

IC50值可作為評價抗氧化劑清除自由基能力的指標，4種竹葉黃酮提取物的IC50可以看出(圖5)，PSLFE清除自由基50%時所需的黃酮濃度最低，其清除DPPH自由基效果優于BHT，其它依次為BHT、BMLFE、NRLFE和PNLFE；當ABTS自由基清除率達到50%時，BHT濃度最低，依次為NRLFE、PSLFE、PNLFE和BMLFE。總體上看，與BHT相比，4種竹葉黃酮提取物中PSLFE和NRLFE抗氧化效果較好。

圖5 4種竹葉提取物的IC50分析Fig.5 IC50 of four bamboo leaves

2.4 竹葉中黃酮含量與抗氧化相關性分析

竹葉黃酮含量與抗氧化活性的相關性差異較大，由表2可知，竹葉中黃酮含量與ABTS自由基清除顯著的正相關性，相關系數在為0.72(P<0.05)，而竹葉中黃酮含量與DPPH自由基清除和FRAP無顯著相關(P>0.05)，相關系數分別為0.30和0.76。

表2 竹葉中黃酮含量與抗氧化相關性分析

3 結論

許多研究表明，竹葉含有豐富的營養物質和黃酮，陸志科和謝碧霞研究了9種竹葉的營養成分，結果表明，粗蛋白質在10.24%～16.68%，總糖含量14.35%～24.61%，水溶性糖含量7.86%～11.45%，總黃酮含量1.18% ～ 2.02%，多糖6.49%～14.55%[6]。Jiang等[9]研究的10種竹的營養成分表明，其粗蛋白在11.64%±0.70%～19.54%±2.76%，粗脂肪1.91%±0.76%～3.59%±0.32%，竹葉粗纖維在37.58%±2.45%～43.29%±4.10%，鈣在0.85%±0.05%～0.93%±0.07%，總磷在0.15%±0.01%～0.27%±0.03%，粗灰分在12.06%±4.32%～16.16%±3.80%。研究表明竹葉中含有豐富的營養和黃酮，尤其是蛋白質、鈣、黃酮等，且不同竹種間營養成分和黃酮存在差異。

目前，人類食品和動物飼料中廣泛添加人工合成的抗氧化劑來提高食品的穩定性和延長食品的保質期，所用的抗氧劑大多數是人工合成的，如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)、叔丁基對二酚(TBHQ)等，許多動物活體實驗已證實，人工合成的抗氧化劑對人和動物機體有一定的毒害作用，甚至有些會致癌、致畸[16]，所以人工合成抗氧化劑的安全性引起了人們的擔憂。而對來源于植物中的天然抗氧化劑的興趣越來越高，尤其是富含黃酮類的植物。研究表明，竹葉含有較高的黃酮，具有很強的清除活性氧自由基和羥自由基的能力。DPPH自由基的清除是一種廣泛用于評價植物來源粗提取物或純化物質清除自由基的常用模型，FRAP和ABTS自由基清除能力經常用于快速評估谷物和蔬菜中各種抗氧化劑的總抗氧化能力。本研究采用FRAP法來反映竹葉黃酮提取物對鐵離子的還原能力，用DPPH和ABTS來評價竹葉黃酮提取物對自由基的清除能力，較全面反映了4種竹葉的抗氧化功效，結果表明，金竹黃酮提取物和孖竹黃酮提取物在體外具有較強的抗氧化性。

植物活性成分的抗氧化能力與總黃酮含量間的關系還存在一些爭議，許多研究表明，植物中總黃酮含量與抗氧化性存在顯著的相關性，即黃酮含量越多其抗氧化性越強，Xu等[17]比較了華南地區5個主要品種番石榴(Psidiumguajava)的總抗氧化能力與黃酮間的關系，結果表明，番石榴的總抗氧化能力與黃酮含量之間具有顯著的相關性(P< 0.05)。Bai等[18]研究了啤酒花(Humuluslupulus)廢棄枝葉多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析，結果表明啤酒花主枝、側枝和葉子多酚、黃酮與抗氧化具有顯著的相關性。但也有研究表明，黃酮含量與抗氧化活性無相關性，尚紅梅等研究表明，菊苣根的抗氧化活性與其中的黃酮含量關系不大，僅ABTS自由基清除能力與黃酮含量顯著正相關，而與總酚含量有很大關系[19]，這與本研究結果一致，本研究表明，竹葉中黃酮含量與ABTS自由基清除顯著的正相關性，與DPPH自由基清除和FRAP無顯著相關。存在這種差異的原因可能是與植物中黃酮結構的復雜性有關，黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的次生代謝產物，迄今為止，有9 000多種不同的結構黃酮類化合物被發現，黃酮類化合物具有多羥基、雙鍵、芳香環等特殊結構，具有抗氧化、清除自由基等作用[20]，但不同的黃酮類化合物由于其結構上的差異表現出不同強度的抗氧化，今后應從植物黃酮粗提取物中分離、純化黃酮，研究其化學結構與抗氧化活性及穩定性關系，為人工合成高效的植物源性抗氧化劑提供指導。