枸杞子HPLC指紋圖譜及其化學(xué)模式識別研究

劉旭霞，裴 棟，劉建飛，鞏 媛，王茂鶴，邸多隆*，郭 玫

1中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 甘肅省中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，蘭州 730000；3青島市資源化學(xué)與新材料研究中心，青島 266000；

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥成熟果實，其味甘性平，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎，益精明目的功效，用于治療虛勞精虧，血虛萎黃，腰膝酸痛，陽痿遺精，內(nèi)熱消渴，眩暈耳鳴，目昏不明等癥狀[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸杞子具有抗氧化、抗AD、降血糖、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)等多種活性[2,3]?！吨袊幍洹?015版中其質(zhì)量控制以枸杞多糖和甜菜堿的含量作為其檢測指標(biāo)，無法全面評價藥材的質(zhì)量，此外由于寧夏枸杞在我國寧夏、甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙等西北地區(qū)均有分布，由于各個產(chǎn)區(qū)生態(tài)地理環(huán)境不同，造成不同產(chǎn)區(qū)的枸杞子質(zhì)量有差別[4,5]。目前有關(guān)枸杞子指紋圖譜的研究均利用相似度評價以及聚類分析，評估其品質(zhì)并進(jìn)行鑒別[6-8]，然而將指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)聯(lián)合構(gòu)建產(chǎn)區(qū)判別的研究較少[9,10]。本研究采用HPLC法對34批樣品進(jìn)行了指紋圖譜研究，開展了相似度評價、聚類分析(cluster analysis，CA)及主成分分析(principal component analysis，PCA)，并利用正交偏最小二乘法(orthogonal partial least squares，OPLS)建立了枸杞子產(chǎn)區(qū)判別模型，以期為不同產(chǎn)區(qū)的枸杞子判別以及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)和新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200液相色譜儀(Agilent Technologies，美國)，包括：G1312A恒流泵，G1315B檢測器，G1328B手動進(jìn)樣器和 Agilent Chemstation software工作站；依利特Sepherisorb ODS C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；AT-950 柱溫箱(天津 Automatic Science儀器有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司，中國)；BSA224S-CW型萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，中國)。XQ100克型多功能高速粉碎機(jī)(上海廣沙工貿(mào)有限公司，中國)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司，中國)；飛鴿牌高速離心機(jī)(上海安亨科學(xué)儀器廠，中國)。

1.2 材料

乙腈(Mreda Technology Inc.，色譜純)；冰乙酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠，中國，色譜純)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；5個不同產(chǎn)區(qū)的枸杞子樣品，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)寧夏枸杞(L.barbarum)，樣品來源見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取枸杞子樣品100 g在60 ℃下干燥4 h取出，用粉碎機(jī)粉碎。精確稱取枸杞子粉末約3.0 g，置于250 mL錐形瓶中，加純凈水45 mL，60 ℃超聲提取30 min，提取液在10 000 rpm條件下離心20 min，將離心液轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，用純水定容至50 mL，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件

采用依利特Sepherisorb ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相由0.3%冰乙酸水(A)和乙腈(B)組成；梯度洗脫條件：0～60 min，95%～75% A；檢測波長：310 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

取1號樣品，按照“2.1”項下方法制備供試品溶液，按2.2色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，以21號峰為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間的RSD為0.14%～2.10%，相對峰面積的RSD為0.39%～3.70%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取1號樣品，按照“2.1”項下方法制備供試品溶液，按2.2色譜條件，分別于0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣測定。共有峰相對保留時間的RSD為0.39%～2.37%，相對峰面積的RSD為0.30%～4.68%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗

取1號樣品，按照“2.1”項下方法制備供試品溶液，按2.2色譜條件，以21號峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.04%～1.53%，相對峰面積的RSD為0.98%～4.91%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 枸杞子指紋圖譜的建立及相似度評價

2.4.1 指紋圖譜的建立

稱取34批枸杞子樣品粉末，按“2.1”項下方法制備樣品溶液，按2.2色譜條件進(jìn)樣測定。將34批枸杞子HPLC色譜圖的數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”，以1、8、12、17和22號樣品HPLC色譜圖為參照譜圖，生成各自產(chǎn)區(qū)枸杞子樣品的共有模式(見圖1)，然后將各個產(chǎn)區(qū)的共有模式導(dǎo)入上述軟件中，以寧夏產(chǎn)區(qū)共有模式為參照譜圖，采用平均數(shù)相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行多點校正，時間窗寬度為0.3 s，進(jìn)行自動匹配，建立枸杞子樣品對照指紋圖譜，共確定28個共有峰(見圖2)。

2.4.2 相似度評價

將34 批枸杞子HPLC色譜圖的數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”，進(jìn)行相似度評價，計算各個產(chǎn)區(qū)枸杞子樣品之間的相似度，見表2。由表2數(shù)據(jù)可知，各產(chǎn)區(qū)內(nèi)枸杞子樣品之間的相似度均大于0.900，說明各個產(chǎn)區(qū)內(nèi)樣品之間整體差異性較小。以寧夏產(chǎn)區(qū)對照指紋圖譜為參照，計算各產(chǎn)區(qū)對照指紋圖譜之間的相似度，見表3，相似度為0.898～0.992，表明不同產(chǎn)區(qū)枸杞子樣品之間有差異性也有相似性。其中寧夏和青海之間的相似度最為靠近，甘肅和內(nèi)蒙之間的相似度接近，新疆和寧夏以及其它地區(qū)的相似度相差較遠(yuǎn)，表明由于產(chǎn)區(qū)地理生態(tài)環(huán)境的差異導(dǎo)致樣品之間有一定的不同。

圖1 不同產(chǎn)區(qū)枸杞子對照指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of Lycii fructus from different origins注：S1.甘肅產(chǎn)區(qū)共有模式；S2.內(nèi)蒙產(chǎn)區(qū)共有模式；S3.寧夏產(chǎn)區(qū)共有模式；S4.青海產(chǎn)區(qū)共有模式；S5.新疆產(chǎn)區(qū)共有模式；R.對照指紋圖譜。Note:S1.Fingerprint of Gansu;S2.Fingerprint of Inner Mongolia;S3.Fingerprint of Ningxia;S4.Fingerprint of Qinghai;S5.Fingerprint of Xinjiang;R.Standard fingerprint.

圖2 枸杞子對照指紋圖譜Fig.2 Standard fingerprint of Lycii fructus

表2 同一產(chǎn)區(qū)枸杞子相似度

表3 不同產(chǎn)區(qū)枸杞子相似度

2.5 化學(xué)計量學(xué)分析

2.5.1 聚類分析

21號峰面積穩(wěn)定、峰形良好、保留時間為35 min左右，選其為參照峰，計算其余28個色譜峰的相對峰面積，將共有峰相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件對枸杞子樣品進(jìn)行聚類分析，采用Ward法，計算樣品之間的分類距離，見圖3。由圖可知，新疆的樣品聚為一類，寧夏的樣品聚為一類，青海的樣品聚為一類，甘肅和內(nèi)蒙的樣品聚為一類，新疆和寧夏的樣品距離相差較遠(yuǎn)，寧夏和青海的樣品距離相差較近，此結(jié)果和相似度分析結(jié)果一致。

圖3 枸杞子聚類圖Fig.3 Classification clustering map of Lycii fructus注：1.甘肅；2.內(nèi)蒙；3.寧夏；4.青海；5.新疆。Note:1.Gansu;2.Inner Mongolia;3.Ningxia;4.Qinghai;5.Xinjiang.

2.5.2 主成分分析

采用SIMCA 14.1軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以枸杞子樣品指紋圖譜中的28個共有峰為變量進(jìn)行主成分分析。前兩個主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)82.3%，可反映大部分特征峰的信息，以前兩個主成分建立坐標(biāo)系得到主成分的得分圖(圖4)。結(jié)果顯示，對于大多數(shù)樣品來說，不同產(chǎn)區(qū)的枸杞子樣品呈現(xiàn)明顯的分離，相同產(chǎn)區(qū)的樣品有很好的集聚，但是甘肅產(chǎn)區(qū)樣品較為離散，可能是由于樣品采集地點的土壤因素及其他環(huán)境因素導(dǎo)致樣品的有效成分含量有差異[11]，導(dǎo)致樣品之間較為離散。新疆產(chǎn)區(qū)的樣品偏離其他產(chǎn)區(qū)樣品較遠(yuǎn)，說明其化學(xué)成分含量與其它產(chǎn)區(qū)存在顯著差異。甘肅與內(nèi)蒙產(chǎn)區(qū)、寧夏與青海產(chǎn)區(qū)樣品較為接近，說明這些產(chǎn)區(qū)的樣品之間化學(xué)成分含量類似，此結(jié)果與相似度分析及聚類分析一致。

載荷圖中每個點代表1個特征峰，其與中心點的遠(yuǎn)近表示該變量在樣品組分中所做貢獻(xiàn)的大小；離中心點的距離越遠(yuǎn)，表示其在不同樣品中差別越大，對分類模型貢獻(xiàn)越大。P12在主成分2上貢獻(xiàn)率最大，為46.0%，P23和P26在主成分1上貢獻(xiàn)率較大，分別為55.2%和41.9%。由載荷矩陣圖(圖 5)得到區(qū)別不同產(chǎn)區(qū)枸杞子的3個(P12、P23、P26)差異化合物。

圖4 樣品PCA得分圖Fig.4 PCA score plot of samples注：1.甘肅；2.內(nèi)蒙；3.寧夏；4.青海；5.新疆。Note:1.Gansu;2.Inner Mongolia;3.Ningxia;4.Qinghai;5.Xinjiang.

圖5 樣品PCA載荷圖Fig.5 PCA loading diagram of samples

2.5.3 產(chǎn)區(qū)判別分析

以共有峰相對峰面積為X變量，不同的產(chǎn)區(qū)為分類變量Y(甘肅為1，內(nèi)蒙為2，寧夏為3，青海為4，新疆為5)，用訓(xùn)練集樣品(1～25號)建立正交偏最小二乘判別模型，模型R2Y為0.947，Y變量的Q2為0.890，說明所建模型良好[12]。以預(yù)測成分的得分值(Tp[1])和第1個正交成分的得分值(To[1])繪制得分散點圖，如圖6所示，不同產(chǎn)區(qū)樣品可以在得分散點圖上明顯區(qū)分。

為驗證所建模型的真實性和可靠性，對模型進(jìn)行置換檢驗，隨機(jī)打亂Y變量的順序200次，觀察Y變量隨機(jī)排列的模型與原始Y變量模型之間的差異[13]。然后對Y變量隨機(jī)排列模型的R2值、Q2值與原始判別模型的R2值、Q2值之間做回歸線，見圖7。最右端原始模型的Q2值和R2值大于左邊任何一個隨機(jī)排列模型的值，Q2于Y軸的截距是負(fù)值，且置換檢驗得到的R2Y=0.283和Q2=-0.673均小于原始值，由此可得此模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，模型的預(yù)測能力良好、可靠[14]。

圖6 訓(xùn)練集樣品OPLS得分圖Fig.6 OPLS score plot of samples from training set注：1.甘肅；2.內(nèi)蒙；3.寧夏；4.青海；5.新疆。Note:1.Gansu;2.Inner Mongolia;3.Ningxia;4.Qinghai;5.Xinjiang.

圖7 OPLS模型的置換檢驗Fig.7 Permutation test of OPLS model

采用所建立的模型，對訓(xùn)練集中的25個樣品進(jìn)行內(nèi)部預(yù)測，對預(yù)測集中的9個隱藏產(chǎn)區(qū)信息的樣品(26～34號)進(jìn)行外部預(yù)測，當(dāng)類別變量計算值YPred PS在1±0.5之間時，判斷為甘肅產(chǎn)區(qū)樣品；在2±0.5之間時，判斷為內(nèi)蒙產(chǎn)區(qū)樣品；在3±0.5之間時，判斷為寧夏產(chǎn)區(qū)樣品；在4±0.5之間時，判斷為青海產(chǎn)區(qū)樣品；在5±0.5之間時，判斷為新疆產(chǎn)區(qū)樣品，若計算值不在相應(yīng)的區(qū)間，表示歸類不明確[15]。圖8中以樣品類別變量的真實值為橫坐標(biāo)，計算值YPred PS為縱坐標(biāo)，繪制散點圖，反映了訓(xùn)練集中樣品類別變量真實值與計算值之間的關(guān)系，內(nèi)部預(yù)測結(jié)果顯示，共有2個樣品(甘肅玉門和寧夏中衛(wèi))被誤判，其判別正確率為89.0%。將預(yù)測集中的9個樣品帶入訓(xùn)練集創(chuàng)建的OPLS模型中進(jìn)行外部預(yù)測，根據(jù)計算得到的類別變量值判斷樣品的產(chǎn)區(qū)，預(yù)測結(jié)果見表4，所有樣品均得到正確識別，表明所建模型可以準(zhǔn)確的預(yù)測未知枸杞子樣品產(chǎn)區(qū)。

圖8 訓(xùn)練集中樣品類別變量真實值與計算值之間的關(guān)系圖Fig.8 Relationship between real values and calculated values of samples from training set

編號No.實際產(chǎn)區(qū)Realorigin預(yù)測產(chǎn)區(qū)Predictedorigin預(yù)測結(jié)果Predictionresul26寧夏中衛(wèi)寧夏正確27寧夏同心寧夏正確28青海都蘭青海正確29甘肅玉門甘肅正確30甘肅瓜州甘肅正確31內(nèi)蒙陜壩內(nèi)蒙正確32內(nèi)蒙包頭內(nèi)蒙正確33新疆精河新疆正確34新疆伊寧新疆正確

3 討論

3.1 試驗條件優(yōu)化

3.1.1 提取溶劑和提取方法的優(yōu)化

分別對不同提取溶劑(水、60%乙醇、甲醇)、提取時間(30 min、1 h、2 h)、提取方法(超聲提取、加熱回流提取、高速剪切提取、恒溫攪拌提取、冷浸)、提取溫度(25、40、60、80 ℃)進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60 ℃下用水超聲提取30 min的色譜峰最多，峰面積大，基線相對平穩(wěn)，同時簡單方便，綠色環(huán)保，最終確定2.1項下供試品溶液的提取方法。

3.1.2 色譜條件的優(yōu)化

考查了不同檢測波長(220、254、280、310、360 nm)、相同規(guī)格(250 mm × 4.6 mm，5 μm)不同型號色譜柱(依利特Sinochrom ODS-AP、依利特Sinochrom ODS-BP、依利特Hypersil BDS C18、 依利特Spherisorb C18、依利特Hypersil ODS2、Megres C18、依利特 Sepherisorb ODS C18)、不同比例和梯度的流動相系統(tǒng)(水、甲醇、乙腈、0.1%乙酸水、0.2%乙酸水、0.3%乙酸水、0.5%乙酸水、1%乙酸水)、柱溫(20、25、30、35 ℃)等對指紋圖譜的影響，以峰數(shù)量、基線平穩(wěn)、峰分離度等為依據(jù)進(jìn)行了篩選，最終確定了2.2項下的色譜條件，該色譜條件下指紋圖譜色譜峰較多，分離效果較好。

3.2 化學(xué)模式結(jié)果討論

不同產(chǎn)區(qū)內(nèi)的枸杞子樣品間相似度分析、聚類分析、主成分分析結(jié)果基本一致，說明各個產(chǎn)區(qū)內(nèi)樣品間的化學(xué)成分組成較為相似。但各產(chǎn)區(qū)間的成分含量存在差異，分析原因可能與不同產(chǎn)區(qū)的土壤、氣候、水分等生態(tài)環(huán)境有關(guān)。有研究表明土壤灌溉水分會影響枸杞子總糖、總酸、總黃酮以及甜菜堿等化學(xué)成分的含量[16-18]，而通過地理國情監(jiān)測云平臺查閱到不同產(chǎn)區(qū)的平均年降水量均有所差異，甘肅和內(nèi)蒙地區(qū)的為400 mm左右，兩者比較接近；寧夏及青海地區(qū)的不足200 mm，這可能就造成了這些產(chǎn)區(qū)之間枸杞子的相似性及差異性。也有研究表明基質(zhì)、地膜覆蓋以及施肥條件會影響枸杞子內(nèi)源營養(yǎng)物以及總黃酮含量[19,20]，造成質(zhì)量差異性。此外，郎振華[21]在進(jìn)行瓜州縣枸杞發(fā)育期監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)枸杞生長與氣溫及光照密切相關(guān)，通過地理國情監(jiān)測云平臺查閱到新疆地區(qū)年均氣溫在-23～17.8 ℃之間，氣溫波動比較大，光照時間較長且降水低，這些因素可能就造成了新疆地區(qū)枸杞子同其他地區(qū)枸杞子相似度不高的原因。通過PCA載荷圖找出導(dǎo)致不同產(chǎn)區(qū)之間具有差異性的色譜峰，為P12、P23和P26，通過OPLS建立了產(chǎn)區(qū)識別模型，模型判別率為89.0%，為了進(jìn)一步驗證所建模型的準(zhǔn)確性，對其他9個隱藏掉產(chǎn)區(qū)信息的枸杞子樣品進(jìn)行了產(chǎn)區(qū)預(yù)測，結(jié)果全部預(yù)測準(zhǔn)確，證明所建模型良好。

綜上所述，本研究將指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)進(jìn)行了有效結(jié)合，建立了一種枸杞子的產(chǎn)區(qū)辨別模型，同時也為其它中藥材產(chǎn)區(qū)的鑒別提供了一種新思路。