一種靶向于生長抑素受體2的藥物篩選模型的建立與應用

顧倩倩，劉 翠，方偉彬，劉培慶，李 民

(中山大學藥學院，新藥成藥性評估與評價國家地方聯合工程實驗室，廣州 510006)

生長抑素(somatostatin，SST)是一種由14個氨基酸組成的環狀多肽，最早于1968年從大鼠的下丘腦中被分離出來[1]。SST可作用于多種器官，包括大腦、垂體、腸道、胰腺、腎上腺、甲狀腺和腎臟等，在機體內主要發揮內源性的抑制作用[2]。SST主要適用于急性胰腺炎，上消化道出血，胰、膽、腸瘺的輔助治療，肢端肥大癥等[3-4]。內源性的SST半衰期較短，通常只有1～3 min，臨床上常用的生長抑素制劑有思他寧、奧曲肽和蘭瑞肽。為了開發更多作用時間長、療效好的生長抑素類似物(somatostatin analogue，SSTA)及激動劑，首先要構建穩定可靠的細胞模型。

SST發揮作用需要靶向于生長抑素受體(somatostatin receptors，SSTRs)，該類受體屬于G蛋白偶聯型受體，共含有5種亞型，分別為SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4以及SSTR5[5]。相對于該受體家族的其它成員，SSTR2分布最廣，與疾病聯系最為緊密[6]。因此本研究選擇以SSTR2為靶點，構建穩定的細胞篩選模型。

細胞內Ca2+作為一種第二信使，通過調整其濃度升高或降低在多種信號通路中發揮作用。鈣流檢測原理為熒光指示劑Fluo-4/AM為酯化形式，與活細胞孵育一段時間后可透過細胞膜進入細胞內，細胞內的酯酶會將其水解成游離酸形式，從而與胞內的Ca2+相互作用，在一定波長下可以檢測到熒光信號的變化[7]。當SSTRs被激活后會與抑制型G蛋白( Gi )相偶聯，從而使細胞內Ca2+濃度上升。本研究旨在構建SSTR2穩定表達的細胞株，為該受體激動劑或SSTA的篩選奠定模型基礎。

1 材料和方法

1.1 材料pENTER-SSTR2購自美國Vigenebio公司；載體pEGFP-N3以及HEK293細胞株由本實驗室保存；PCR酶購自日本TOYOBO公司；XhoI、BamHI以及T4 DNA連接酶購自美國Thermo公司；轉染試劑Lipo 2000、鈣離子指示劑Fluo-4/AM購自美國Invitrogen公司；G418粉末購自中國浩瑪公司；HBSS購自美國HyClone公司；pluronic F-127、Probenecid購自中國美倫公司；BSA購自中國翔博生物公司；96孔黑壁底透板購自美國Costar公司； GAPDH抗體(6004-1-lg)購自美國Proteintech公司；GFP抗體(sc-9996)購自中國Santa Cruz公司；思他寧制劑購自瑞士Merck公司；Flex Station 3多功能酶標儀工作站購自美國Molecular Devices公司；化學發光成像系統購自美國Azure公司。

1.2 質粒構建[8]根據載體pEGFP-N3及SSTR2目的基因序列信息設計引物，F: 5′-CCGCTCGAGCTATGGACATGGCGGATGAGCCA-3′ (XhoI) ; R: 5′-CGGGATCCGATACTGGTTTGGAGGTCTC-3′ (BamHI)。以pENTER-SSTR2作為模板，按照KOD酶說明書操作，PCR擴增獲得約1.1 kb的目的片段，用膠回收試劑盒對其進行回收。將回收后的目的片段與載體pEGFP-N3用XhoI和BamHI進行雙酶切，酶切產物回收后用T4 DNA連接酶連接。最后用DH5a感受態細胞對連接產物進行轉化，轉化的菌板置于37 ℃培養箱過夜。次日，挑取3個單菌落進行菌落PCR。選取陽性克隆搖菌提質粒，進行雙酶切鑒定并送公司測序，將測序結果與人源SSTR2序列比對。獲得的重組質粒命名為SSTR2-pEGFP-N3。

1.3 細胞轉染及觀察將HEK293細胞接種于60 mm培養皿，細胞在貼壁12～24 h后密度占0.60～0.80。將SSTR2-pEGFP-N3重組質粒以及空白質粒pEGFP-N3按Lipo2000試劑說明書步驟分別進行轉染，4～6 h后更換為無雙抗的完全培養基。繼續培養至24 h，使用熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光，對比兩組細胞綠色熒光的分布。

1.4 mRNA水平驗證提取實驗組SSTR2-GFP-HEK293與對照組pEGFP-N3-HEK293兩組細胞的RNA，按照逆轉錄試劑盒操作說明逆轉錄成cDNA。設計qPCR引物：GAPDH-F: 5′-ACCCACTCCTCCAC CTTTGA-3′, R: 5′-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3′; SSTR2-F: 5′-TGGCTATCCATTCCATTTGACC-3′, R: 5′-AGGACTGCATTGCTTGTCAGG-3′。取適量cDNA加入SYBR Green Mix及引物，利用實時熒光定量PCR儀進行qPCR。根據實驗所得Cp值計算實驗組與對照組中SSTR2的相對mRNA表達水平。

1.5 Western-blot驗證將實驗組及對照組細胞分別接種于35 mm培養皿中，待細胞貼壁后，倒棄培養基，加入細胞裂解液，收集細胞置于冰上裂解30 min。離心取蛋白上清，使用BCA試劑盒定量，兩組蛋白樣品均為20 μg，沸水浴5 min使蛋白變性。采用70 V、30 min濃縮，120 V、60 min分離的條件進行電泳，230 mA、90 min的條件進行電轉。電轉完牛奶室溫封閉1 h，并于4 ℃環境中過夜孵育一抗GAPDH及GFP。用TBST清洗3次，洗完后的PVDF膜室溫孵育對應二抗1 h，TBST清洗后用化學發光成像儀顯影曝光，對目的蛋白條帶進行分析。

1.6 穩轉細胞株的篩選將鑒定成功的SSTR2-GFP-HEK293細胞用1 g·L-1的G418篩選。篩選一周之后，用胰酶消化細胞，取少量細胞種于96孔板的A1孔中，使細胞數量大致在4 000～5 000個。對A1孔中的細胞進行橫豎梯度稀釋，使單克隆細胞集中分布于96孔板的右下方部位。種好的96孔板置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養兩個星期左右，期間3～5 d換一次液。待單克隆長成較大的集落，于熒光顯微鏡下挑取帶綠色熒光的克隆，即陽性克隆。陽性克隆擴大培養，獲得SSTR2過表達的穩轉細胞株，命名為SSTR2-GFP-HEK293。

1.7 鈣流檢測體系的建立取適量SSTR2-GFP-HEK293細胞種于96孔黑壁底透的培養板中，待細胞貼壁24 h后，開始鈣流檢測。參考文獻[9-10]，首先配制鈣流檢測工作液：2 μmol·L-1的Fluo-4/AM、質量分數為0.05% 的Pluronic F-127、2.5 mmol·L-1Probenecid、質量分數為0.1%的 BSA，溶劑為含鈣鎂不含酚紅的HBSS。用預熱至37 ℃含質量分數為0.1% BSA的HBSS溶液清洗細胞兩次。清洗后，每孔加入50 μL的鈣流檢測工作液，于培養箱中孵育40 min。用相同的HBSS溶液清洗細胞，至少1次。洗后每孔加入160 μL含質量分數為0.1% BSA的HBSS溶液，于培養箱中放置10 min。為了驗證鈣流檢測體系的可行性，使用陽性藥離子霉素(Ionomycin)，配制成20 μmol·L-1的母液(5×)，用Flex station 3檢測激發波長485 nm，發射波長525 nm下的熒光。

1.8 檢測條件的優化在確定檢測體系可行性以及構建的SSTR2-GFP-HEK293穩轉細胞株在生長抑素制劑思他寧的刺激下會產生特異性鈣流信號變化后，為了獲得較高的信號窗口(ΔRFU)以及相對經濟適宜的篩選條件，本研究對檢測細胞數量、熒光指示劑濃度、以及指示劑的孵育時間進行了優化。在40 μmol·L-1生長抑素制劑思他寧的作用下對比每孔10 000～50 000個細胞，熒光指示劑濃度為2～5 μmol·L-1，指示劑孵育時間分別為30、45、60、75、90、105 min相應條件下ΔRFU的變化。在最適條件下對3個不同批次SSTR2激動劑思他寧進行EC50檢測。

1.9 統計學分析所有數據分析均采用GraphPad Prism 5軟件。實驗組與對照組鈣流信號ΔRFU采用兩組間t檢驗數據處理分析，EC50值通過非線性擬合獲得。每組實驗均設置3個復孔, ΔRFU為鈣流信號最大值與前20 s儀器加樣前基線平均值的差值。Stimulation/%=(ΔRFU-ΔRFUmin)/(ΔRFUmax-ΔRFUmin) ×100%

2 結果

2.1 SSTR2-pEGFP-N3質粒的鑒定由PCR擴增獲得1.1 kb的SSTR2目的條帶(Fig 1A)，挑取3個克隆進行菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示3個為陽性克隆(Fig 1B)。選取其中1號克隆搖菌提質粒，并用XhoI、BamHI進行雙酶切，酶切獲得全長質粒(5.8 kb)、載體(4.7 kb)以及SSTR2基因(1.1 kb)的目的條帶，符合對應片段大小(Fig 1C)。雙酶切鑒定成功的質粒測序進一步確認，測序結果顯示與NCBI上SSTR2的目的序列完全匹配。

Fig 1 Construction and identification of recombinant plasmids SSTR2-pEGFP-N3

A: The fragment of SSTR2 was amplified by PCR from the template of pENTER-SSTR2; B: The positive plasmids with SSTR2 were identified using colony PCR; C: The recombinant plasmid was identified by double digestion of XhoI and BamHI.

2.2 SSTR2-GFP-HEK293穩轉細胞株的鑒定用熒光顯微鏡觀察轉染了重組質粒SSTR2-pEGFP-N3以及對照組pEGFP-N3質粒24 h后的HEK293細胞。過表達SSTR2的實驗組細胞的綠色熒光在細胞膜上均勻分布，符合該受體的分布情況，而對照組細胞的綠色熒光則分散于整個細胞質中(Fig 2A)。Western blot結果顯示SSTR2-GFP-HEK293穩轉細胞成功表達了SSTR2與GFP標簽的融合蛋白(Fig 2B)。qPCR結果也顯示相比于對照組，在SSTR2-GFP-HEK293穩轉細胞中SSTR2基因mRNA水平明顯上調，進一步表明該穩轉細胞株成功表達了SSTR2基因。

2.3 鈣流檢測模型的建立基于文獻調研，初步建立了鈣流篩選體系。為驗證該體系的可行性，使用了陽性藥離子霉素(Ionomycin)。離子霉素是一種離子載體，對Ca2+有很好的親和力，不僅可以使其從胞外進入胞內，還能促進其從胞內的庫釋放到細胞溶質內。實驗結果表明離子霉素可以顯著的升高細胞內的鈣信號值，而溶劑對照組則幾乎沒有鈣流信號的變化(Fig 3A)，表明該體系能有效地檢測到細胞內的鈣流信號變化。在確定體系可行性后，對SSTR2-GFP-HEK293細胞模型有效性進行鑒定。在離子霉素驗證后的體系，將刺激藥物換成SSTR2受體激動劑生長抑素制劑，以pEGFP-N3-HEK293細胞作為對照。結果顯示實驗組細胞在思他寧的刺激下會產生濃度依賴性的鈣流信號增加，而對照組則未出現鈣流信號變化(Fig 3B)。

Fig 2 Identification of stable cell lines

2.4 鈣流檢測體系的優化將鈣流信號以ΔRFU表示，結果顯示當細胞個數為30 000/孔時ΔRFU值與本底有統計學差異(P<0.05)，所以最終確定每孔30 000個細胞運用于接下來的檢測體系中(Fig 3C)。在對熒光指示劑Fluo-4/AM濃度進行優化時，發現ΔRFU隨著指示劑的濃度增加而增加。為了獲得相對較大的ΔRFU值，以及考慮到后期做大量篩選的成本問題，選用了3 μmol·L-1的Fluo-4/AM作為后期篩選的工作濃度(Fig 3D)。優化熒光指示劑孵育時間結果顯示，當孵育45 min時，ΔRFU顯著增加(P<0.01)，就算進一步延長孵育時間也不能更有效的提高ΔRFU，為了后期篩選工作的高效及迅速，確定熒光指示劑的孵育時間為45 min(Fig 3E)。

2.5 SSTR2-GFP-HEK293細胞篩選模型的應用對3個批次(批號分別為AU021084、AU022158、AU020854)的生長抑素制劑思他寧進行檢測，EC50值分別為51.37 pmol·L-1、81.14 pmol·L-1、56.80 pmol·L-1(Fig 3F)。結果表明，不同批次的思他寧EC50值接近，符合已上市藥生產規范，同時也表明該檢測體系的穩定有效性。

3 討論

SST及SSTA已被臨床應用于治療多種人類疾病，如促腎上腺皮質激素過量引起的庫欣綜合征，生長激素過度釋放導致的肢端肥大癥，以及消化道出血等。研究表明相對于該受體家族的其它成員，SSTR2的分布最為廣泛，尤其是在一些腫瘤組織中[3]。SSTR2與癌癥治療相關的研究逐年增加，該受體在多種癌細胞及腫瘤血管中異常表達[11-12]。當體內受體被激活時會產生抑制激素分泌和細胞增殖的效應，該效應與癌癥的發生發展密切相關。SSTA目前已被開發為抗腫瘤的輔助藥物，部分長效制劑甚至直接發揮抗腫瘤作用，如奧曲肽[13]。開發作用時間長、療效好的SSTRs激動劑和SSTA，不僅為消化道出血、急性胰腺炎以及肢端肥大癥等疾病提供更多的用藥選擇，同時也可作為癌癥治療的一種新策略。本研究選擇建立靶向于SSTR2的體外篩選模型，便于篩選出特異性靶向該受體的激動劑及類似物。

Fig 3 Optimization and application of calcium flow detection system

配體與受體的結合會使體內的第二信使產生一系列的生理變化，常見的第二信使有cAMP、cGMP、Ca2+等。本研究前期有檢測過cGMP的信號變化，發現該模型在生長抑素制劑思他寧的作用下，cGMP的信號難以檢測到。對比通過鈣流的方式檢測體內Ca2+的信號變化，鈣流檢測方法更為敏感，易于檢測。

本研究建立的細胞篩選模型，從檢測細胞的數量、熒光指示劑的濃度，以及指示劑孵育的時間等方面對鈣流檢測體系進行了優化。確定30 000個細胞每孔，Fluo-4/AM指示劑濃度為3 μmol·L-1，孵育時間為45 min相對適宜的檢測條件，為后續該篩選模型的應用奠定了基礎。

以SSTR2為靶點的篩選模型的建立，不僅可以為尋找新的SSTR2激動劑及SSTA提供有效的方法，同時也適用于新藥研發過程中對未上市藥進行體外藥效評估及產品質量控制。

(致謝：本實驗在中山大學藥學院的新藥成藥性評估與評價國家地方聯合工程實驗室完成，在此對給予實驗幫助的老師和同學表示感謝。)