白花丹醌對大鼠肝星狀細胞活性氧及TGF-β1/Smad信號通路的影響

王聲善，趙 川，陳永欣，唐愛存，彭 岳，劉雪梅，林宇寧，陳婉君，韋燕飛

(1. 廣西中醫藥大學基礎醫學院生理學教研室，廣西 南寧 530021；2. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，廣西 南寧 530023)

肝纖維化是由慢性肝病引起的，與肝硬化高發病率和高死亡率密切相關。慢性氧化應激是啟動肝臟纖維化過程的重要病因。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是內源性、肝臟特異性間充質細胞，在肝臟炎癥和纖維化發生中起關鍵作用[1]。在正常肝臟中，HSC含有維生素A脂滴。通過肝損傷激活，靜息HSC成為活化的HSC，其特征在于α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達，產生炎性細胞因子、趨化因子和細胞外基質蛋白(extracellular matrix，ECM)[2]。研究表明，氧化應激可以刺激HSC的活化，其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)與HSC激活密切相關。ROS是由各種肝臟損傷產生的，如酒精濫用、肝炎病毒感染和慢性膽汁淤積，并有助于肝纖維化[3]。ROS可刺激膠原蛋白I的產生，是轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和Smad作用于肝纖維化的細胞內信號傳導介質[4]。由于HSC在ECM形成中的重要作用，HSC的活化被認為是肝纖維化的重要部分。TGF-β1是引起ROS產生的主要細胞因子，可通過激活其下游Smad信號通路，刺激HSC的激活和增殖[5]。因此，TGF-β1/Smad信號被認為是預防和治療肝纖維化的潛在靶標。

白花丹(PlumbagozeylanicaL)別名為“白雪花”“三錢三”或“猛老虎”，白花丹有效成分為白花丹醌(plumbagin)。眾多研究結果表明，白花丹醌具有抗炎、抗菌、抗氧化應激、抗肝纖維化、抗腫瘤等藥理學作用[6-8]。然而，白花丹醌對肝纖維化的作用機制尚不清楚，需要進一步研究。本實驗分離培養原代HSC，經TGF-β1誘導，觀察白花丹醌對原代HSC的影響，檢測其對ROS表達及TGF-β1/Smad信號的影響，探討白花丹醌的潛在抗肝纖維化機制，為民族醫藥深入開發利用及其臨床應用提供實驗基礎和理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物SD大鼠，體質量(140～180) g，購自廣西醫科大學實驗中心，生產批號：SCXK-Gui-2014-0002。

1.2 藥物與試劑白花丹醌(Sigma公司，批號：20071028)；0.25%胰酶(Gibco公司，批號：15050065)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0010)、磷酸酶抑制劑(批號：S1873)，均購自碧云天公司；兔多抗p-Smad2/3(CST公司，批號：8828)；兔單抗Smad2/3(Abcam公司，批號：Ab202445)；兔多抗Smad7(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1399)；DCFH-DA(批號：S0033)、DAPI(批號：C1002)，均購自碧云天公司；Collagen III抗體(三鷹公司，批號：22734-1-AP)；TGF-β1(Peprotech公司，貨號：100-21)。

1.3 儀器IX51倒置顯微鏡(Olympus公司)；MULTISKAN MK3酶標儀(Thermo公司)；DYCZ-24DN垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；HI650離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；T8-1磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器廠)。

2 方法

2.1 原代大鼠HSC的分離與培養大鼠以戊巴比妥鈉麻醉，同時皮下注射5 000 U肝素鈉抗凝；皮膚常規消毒后打開腹腔，鈍性分離門靜脈及下腔靜脈；以16號套管針作門靜脈插管，37 ℃灌注D-Hanks液，10 mL·min-1至肝臟充盈，剪開下腔靜脈放血后結扎。立即打開胸腔，以16號套管針作上腔靜脈插管，形成門靜脈-上腔靜脈循環；以0.1%鏈霉蛋白酶E 5 mL·min-1灌注3～4 min，0.03%Ⅱ型膠原酶5 mL·min-1灌注3～4 min；取出肝臟，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入鏈霉蛋白酶E至終濃度為0.006%、DNA酶至終濃度為10 pug/mL。37 ℃、5% CO2孵箱內消化30 min；過200目篩網，培養液洗4次，將細胞鋪于制備好梯度的細胞分離管中，對照管中加入等量培養液;4 ℃、800×g平拋離心30 min。吸取1.040密度層的上層細胞，培養液洗2次，加入無血清RPMI l640培養液，于37 ℃、5% CO2孵箱孵育15 min，吸取細胞懸液，在6孔板中以含20%胎牛血清的RPMI 1640培養。24 h后換液，此后每3 d換液1次[9]。

2.2 MTT法檢測HSC增殖情況經過原代細胞的分離培養，用完全培養基調整細胞密度到3×104個接入96孔板，每孔100 μL細胞懸液，每組設3個復孔，分別加入白花丹醌(1、2、4、8、16 μmol·L-1)，同時設空白組。37 ℃培養24 h；接著每孔加入10 μL MTT，37 ℃培養4 h；吸出培養基，加入150 μL DMSO震蕩10 min。酶標儀測定各孔吸光度值(OD568)，計算細胞活力抑制率。細胞活力抑制率/%=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

2.3 熒光探針法測定細胞內ROS水平取對數生長期細胞，用完全培養基調整細胞密度到3×104個接種于96孔板，每組3個復孔，同時設空白對照組，每孔100 μL細胞懸液，同時設空白組，37 ℃培養過夜；按分組更換100 μL含白花丹醌(2、4、8 μmol·L-1完全培養基，37 ℃培養48 h；每孔更換終濃度為10 μmol·L-1DCFH-DA的無血清DMEM培養基100 μL，37 ℃培養20 min；無血清培養基洗滌細胞3次；熒光酶標儀檢測(激發光488 nm，發射光525 nm)。

2.4 Western blot檢測Smad蛋白表達制備裂解液，低溫提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組蛋白濃度；將提取的蛋白上清與5×蛋白上樣緩沖液放入沸水中，沸水浴10 min；制備5%濃縮膠和12%分離膠，上樣后電泳分離，電轉移120 min，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉PVDF膜，室溫搖床封閉2 h，磷酸化蛋白用1%～3%的BSA封閉。一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5～6次，每次5 min。加入HRP標記二抗(1 ∶50 000稀釋)，37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗膜5～6次，每次5 min。將ECL工作液滴加于PVDF膜上，X線膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結果

3.1 原代大鼠HSC形態變化倒置顯微鏡下觀察大鼠HSC，在分離后d 1，HSC開始貼壁，細胞呈卵圓形狀態，胞體變大、變平；細胞呈散在分布，可見單核或雙核肝細胞；分離后d 3，細胞全部貼壁，胞質中脂滴減少、逐漸消失，HSC形態多樣，部分細胞已出現多角偽足，呈星狀；分離后d 5，HSC呈現不規則多角形，相鄰HSC連接更加緊密，形成島狀或條索狀；細胞呈對數生長期，細胞增殖速度增加，呈梭形；分離后d 8，細胞鋪滿培養板，細胞形態由梭形變為類纖維狀(Fig 1)。

3.2 免疫熒光法鑒定HSC中α-SMA的表達通過觀察典型的HSC形態變化，分離的原代細胞活化后，經α-SMA免疫組織熒光鑒定，呈陽性表達，陽性率達91%,獲得了高純度的大鼠原代HSC(Fig 2)。

3.3 白花丹醌對HSC增殖的抑制作用MTT結果顯示(Tab 1)，白花丹醌2～16 μmol·L-1對細胞活力的抑制率明顯，且抑制率隨濃度的增加而提高。為避免高濃度白花丹醌對細胞毒性的未知影響，后續實驗選擇白花丹醌2、4、8 μmol·L-1作為實驗濃度。

GroupConcentration/μmol·L-1OD(24 h)Inhibitoryrate/%Control-0.388±0.021-Plumbagin10.381±0.021220.329±0.016?1540.186±0.013??5280.129±0.009??67160.059±0.011??85

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.4 白花丹醌對HSC形態的影響如Fig 3所示，正常的HSC隨著培養天數的增加，數量不斷擴增，細胞形態由原來的星狀結構變為肌纖維狀。從細胞的形態來看，與空白組比較，TGF-β1組越來越多細胞更接近于肌纖維狀；與TGF-β1組比較，NADPH氧化酶抑制劑DPI及白花丹醌各濃度組可以抑制HSC向肌纖維狀變化，保持HSC的星狀結構，使細胞更長時間處于靜息狀態。

3.5 白花丹醌對HSC內ROS水平的影響熒光探針法檢測結果顯示(Fig 4)，與空白對照組相比，模型組HSC內綠色熒光明顯增強，表明ROS水平明顯升高。與模型組相比，給藥組細胞內綠色熒光信號明顯減弱，DPI組和白花丹醌各濃度組可不同程度下調ROS的水平，隨著白花丹醌濃度的增加，HSC內熒光強度明顯減弱，且綠色熒光的細胞數明顯減少。另外，與模型組相比，DPI組和白花丹醌組ROS熒光密度值明顯降低，與正常組比較，差異無顯著性。

Fig 1 Morphological changes of primary rat HSC(×400)

Fig 2 Immunofluorescence identification of α-SMA(×200)

Fig 3 Morphological observation of HSC(×200)

Fig 4 Effect of plumbagin on ROS production in HSC(×200)

Fig 5 Effect of plumbagin on α-SMA in HSC(×200)

3.6 白花丹醌對HSC中α-SMA和collagen III蛋白表達的影響如Fig 5所示，與對照組比較，TGF-β1刺激的HSC中α-SMA和collagen III呈現陽性表達，表明細胞造模成功。隨著白花丹醌濃度的增加，α-SMA和collagen III表達逐漸下調，DPI組與白花丹醌處理組中α-SMA和collagen III表達均降低。

3.7 白花丹醌對HSC中Smad蛋白表達的影響Fig 6的Western blot結果顯示，與對照組比較，TGF-β1刺激組中p-Smad2/3、Smad2/3表達升高，而Smad7表達降低；與TGF-β1組比較，DPI組及白花丹醌各濃度處理組中p-Smad2/3的表達降低，抑制其活性，但總Smad2/3無明顯變化；相反，DPI及白花丹醌各濃度處理組中，Smad7蛋白水平明顯上升，差異有統計學意義。

Fig 6 Effect of plumbagin on protein expression of Smad in HSC detected by Western

1:Control; 2:TGF-β1; 3:DPI; 4:Plumbagin 2 μmol·L-1; 5:Plumbagin 4 μmol·L-1; 6:Plumbagin 8 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1.

4 討論

肝纖維化在多種慢性肝病的發展階段常見，其特征在于肝臟內ECM的過度沉積導致[10]。現已證明，由NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)產生的ROS是細胞內信號轉導的第二信使，介導了各種促肝纖維化因子的細胞內信號轉導。研究表明，ROS可直接刺激HSC的增殖與活化，促進肝纖維化的發生[11]。本研究結果顯示，HSC經過白花丹醌(2～16 μmol·L-1)處理后，對細胞活力的抑制率高于10%，對TGF-β1刺激的活化型HSC的生長具有明顯的抑制作用。TGF-β1刺激的模型復制成功后，給予白花丹醌作用24 h后，HSC由肌纖維狀變為星狀結構，使細胞由活化狀態轉為靜息狀態，對細胞的增殖有抑制作用；熒光探針法檢測結果顯示，白花丹醌藥物組可不同程度下調HSC中ROS水平，提示白花丹醌抑制HSC增殖和活化功能的機制之一可能與下調ROS等抗氧化功能有關。此外，α-SMA是HSC活化的標志之一，白花丹醌可降低HSC中α-SMA蛋白表達，從而使HSC更多的處于靜息狀態。

TGF-β超家族是一組多功能多肽，包括TGF-β1、骨形態發生蛋白、抑制素和激活素。與肝硬化密切相關的TGF-β由5個成員組成，TGF-β1～TGF-β5，其中只有TGF-β1與肝纖維化相關[12]。TGF-β1廣泛存在于動物的正常組織和轉化細胞中，骨組織和血小板中含量最豐富[13]。它可以抑制增殖，誘導細胞分化和免疫抑制，促進ECM合成，調節膠原蛋白的產生和組織修復。TGF-β1濃度在正常肝臟中較低，但在肝臟損傷發生時明顯增加。當肝纖維化期間由各種致病因子誘導時，肝實質細胞、庫普弗細胞、竇狀內皮細胞、成纖維細胞、血小板和其他遷移性炎癥細胞可釋放大量TGF-β1。此外，活化的HSC最終成為TGF-β1產生的主要來源，形成正反饋回路[14]。本研究體外實驗也證實，HSC可被TGF-β1激活，白花丹醌可抑制HSC中Smad信號通路的表達，從而抑制細胞活化，減緩肝纖維化進程。

TGF-β1/Smad信號通路由3部分組成：細胞外TGF-β1、膜結合TGF-β1受體和細胞內Smad蛋白。存在至少5種不同類型的TGF-β1受體，其中TβR-I和TβR-II是信號轉導受體，其是信號轉導所必需的。TβR是包含跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，在沒有配體的情況下，它們仍然是二聚體。一旦TGF-β1與其受體結合，即TβR-I和TβR-II激活，然后催化下游Smad分子上絲氨酸殘基的磷酸化。最后，磷酸化的Smad進入細胞核，并調節與肝纖維化相關的靶基因的轉錄。Smad是I型受體中唯一已知的細胞內底物。Smad家族蛋白包括至少9種Smad蛋白，即Smad 1～9，其分為受體激活的Smad(R-Smad)，共同途徑Smad(Co-Smad)和抑制性Smad(I-Smad)。R-Smad蛋白，如Smad2和Smad3，主要可促進肝纖維化，而I-Smad如Smad7，可抑制或調節TGF-β信號轉導，并抑制肝纖維化。由于TGF-β1/Smad信號轉導途徑在肝纖維化中的重要作用，阻斷其信號轉導是預防和治療肝纖維化的潛在策略[15]。本研究發現，白花丹醌下調Smad2/3和p-Smad2/3的表達，并上調Smad7的表達，從而抑制TGF-β1/Smad信號通路。

總之，白花丹醌是從白花丹中提取的有效抗纖維化成分。白花丹醌可以調節ROS的表達；在TGF-β1/Smad信號轉導途徑中，白花丹醌也下調α-SMA、Smad2/3和p-Smad2/3的表達，上調Smad7的表達。提示白花丹醌可能通過降低ROS的產生，從而抑制HSC的活化。因此，白花丹醌是治療肝纖維化的潛在藥物。