淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方對APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠海馬CA3區hepcidin表達的影響

馬冬雪，董賢慧，賀小平，許力軍，劉亞磊，高維娟

(1.承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫學院，河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年癡呆的主要原因，是以進行性癡呆為主要特征的神經退行性疾病，主要臨床表現為進行性認知功能障礙和記憶力衰退，性格和行為改變，判斷力下降，生活自理能力喪失。AD是一種多病因介導的疾病，其發病機制學說有很多，目前仍不明確。研究發現，AD患者的腦鐵水平異常升高[1-2]，異常增高的腦鐵啟動機體級聯放大機制，最終導致神經元死亡[3]。臨床研究發現可以應用去鐵劑來改善患者的臨床癥狀及生活自理能力[4]，但因其毒副作用強、口服效果差等缺點限制了臨床應用[5]。

鐵調素(hepcidin)是近年來發現的重要的鐵調節激素，能夠精確調控鐵的吸收、儲存和釋放過程。因此，檢測海馬區hepcidin的表達水平對探討藥物治療療效有一定的意義。

中醫認為AD發病以腎虛精虧，氣血不足為本，痰瘀互結，濁毒內生為標的本虛標實之證。根據中醫“標本兼治”的治療原則，治療AD應補腎健脾，益氣養血以培其本，化痰、祛瘀、解毒以治其標。因此，我們課題組以APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠為動物模型，將淫羊霍、黃芪、葛根素活性成分組方，采用免疫熒光、Real-time PCR、Western blot的實驗方法分析淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方對APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠海馬CA3區hepcidin表達的影響，以期為AD的治療提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組10月齡雄性APPswe/PS1dE9雙轉基因模型小鼠30只，體質量(26±4)g，分別為復方組、模型組和DFX組，每組10只。10月齡雄性C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組。APPswe/PS1dE9雙轉基因模型小組許可證號為SCXK(魯)2016-0001，由山東斯科貝斯生物科技股份有限公司提供。C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，單籠喂養動物飼料及飲水，保持12 h的明暗周期，室溫25 ℃，濕度50%。

1.2 主要藥品和試劑南京澤朗醫藥科技有限公司提供的黃芪甲苷、淫羊藿苷和葛根素；大連美侖生物技術有限公司的DFX；hepcidin兔多克隆抗體NBP1-59337：novus公司；Anti -beta actin rabbit polyclonalGB11001：武漢賽維爾生物科技有限公司；江蘇碧云天公司的Western一抗稀釋液P0023A；Thermo Scientific的蛋白Marker #26616；HRP標記山羊抗兔IgG GB23303：武漢賽維爾生物科技有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus) RR820A：TaKaRa公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time) RR047A:TaKaRa公司；Hepcidin25 BS8870R：博奧森生物有限公司。

1.3 儀器DM5000B型光學顯微鏡、EG11508型組織包埋機、RM2255型全自動輪轉切片機均購于Leica公司；實時熒光定量PCR儀CFX Connectgou型、蛋白電泳和轉膜轉移儀購于美國Biorad；制冰機BF320AS型購于意大利斯科茨曼公司；多功能成像系統Fusion FX5 Spectra型購自于法國Vilber。

1.4 給藥方案實驗動物從10月齡開始用藥，給藥1個月至小鼠11月齡。以黃芪、淫羊藿、葛根有效組分復方給予復方組小鼠灌胃，黃芪甲苷、淫羊藿苷和葛根素的臨床用量分別為80 mg·kg-1、120 mg·kg-1和80 mg·kg-1。正常對照組和模型組小鼠以等量生理鹽水灌胃，DFX組以DFX灌胃，劑量為100 mg·kg-1。所有動物每次灌胃藥液的量均以0.1 ml/10 g計，每日1次。

1.5 取材每組取3只小鼠麻醉后斷頭取腦。然后用4%多聚甲醛體外固定24 h，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，免疫熒光染色。各組剩余的7只小鼠斷頭取腦后取小鼠海馬組織，將海馬組織分為左側和右側兩部分，其中左側海馬組織用來做Real-time PCR檢測，右側海馬組織用來做Western blot檢測。

1.6 免疫熒光檢測小鼠海馬CA3區hepcidin蛋白的表達在切片上滴加PBS按照1 ∶50稀釋的一抗，4 ℃的濕盒內過夜。將處理好的切片放入pH 7.4的PBS中充分漂洗后，以1 ∶300比例加入山羊抗兔二抗并于室溫下培養50 min。漂洗后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于TG全景組織細胞定量分析系統觀察海馬CA3區hepcidin蛋白的表達情況。

1.7 Western blot檢測小鼠海馬CA3區hepcidin蛋白的表達提取各組小鼠海馬區蛋白，BCA蛋白定量。各組上樣量為40 μg，電泳。轉移到0.45 μm的PVDF膜上，5%牛奶封閉2 h，兔抗β-actin，兔抗hepcidin 4 ℃孵育過夜，洗膜。滴加相應二抗，室溫孵育1 h，洗膜。采用ImageJ軟件分析測量灰度值。

1.8 Real-time PCR檢測小鼠海馬CA3區hepcidin mRNA的表達試劑盒提取各組RNA，A260/A280進行紫外分光光度計檢測，以吸光度值為基礎進行RNA濃度檢測。按照PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)取1μg的總RNA樣本進行反轉錄。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，目的基因hepcidin引物(上游：5′-AGCAGCACCACCTATCTCCA-3′，下游：5′-TATC GCAATGTCTGCCCTGC-3′)，內參基因β-actin引物(上游:5′-ACAGCTTCTTTGCAGCTCCTTC-3′，下游：5′-CCACGATGGAGGGGAATACAG-3′)，應用TaKaRa公司TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)進行以下操作；以5倍梯度稀釋5個濃度的cDNA樣本，確定目的基因與β-actin基因擴增標準曲線并確定擴增效率。上下游各取0.8 μL引物，取12.5 μL TB Green Premix Ex TaqⅡ (TliRNaseH Plus)(2×)，1 μLPCR Reverse Primer (10 μmol·L-1)和PCR Forward Primer (10 μmol·L-1)，另取8.5μL滅菌用水和2 μL DNA模板(<100 ng)，反應物總體積25 μL，于Real time PCR儀進行PCR擴增。待測樣品的目的基因表達相對數量用2-△△CT表示。

2 結果

2.1 免疫熒光結果應用免疫熒光單標和TG全景組織細胞定量分析系統觀察小鼠海馬CA3區hepcidin陽性表達水平，hepcidin蛋白陽性表達為綠色。Fig 1結果顯示，APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠海馬CA3區hepcidin陽性表達明顯降低(P<0.05)，淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方和DFX灌胃干預后，hepcidin陽性表達水平較APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠海馬CA3區明顯升高(P<0.05)。復方組和DFX組相比，hepcidin陽性表達水平差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 1 Effects of active components of Epimedium, Astragalus and Radix Puerariae on expression of hepcidin in hippocampus CA3 in APPswe/PS1dE9 double transgenic Alzheimer’s disease

Control: C57BL/6J; Model: APPswe/PS1dE9 double transgenic AD model mice; Tg effective fraction: After Tg effective fraction treatment; DFX: After deferox treatment.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.2 Real-time PCR和Western blot結果Real-time PCR(Fig 2)及Western blot(Fig 3)結果顯示，APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠海馬CA3區hepcidin在mRNA水平和蛋白水平均較正常對照組明顯降低(P<0.05)，給予淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方和DFX灌胃處理后，hepcidin表達水平較APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠海馬CA3區明顯升高(P<0.05)。復方組和DFX組相比，hepcidin在mRNA水平和蛋白水平差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 2 Effects of active components of Epimedium, Astragalus and Radix Puerariae on expression of hepcidin mRNA in hippocampus CA3 in APPswe/PS1dE9 double transgenic Alzheimer’s disease model n=10)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

Fig 3 Effects of active components of Epimedium, Astragalus and Radix Puerariae on expression of hepcidin protein in hippocampus CA3 in APPswe/PS1dE9 double transgenic Alzheimer’s disease model n=10)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

3 討論

AD已成為威脅老年人生活質量并導致死亡的最嚴重疾病之一[6]，AD的患病率隨著年齡的增長呈逐步上升趨勢，在65歲以上人群中發病率為5%，而在85歲以上人群中發病率已高達20%。AD是一種多病因介導的疾病，其發病機制學說有很多，其中包括以Aβ毒性學說為核心的Tau蛋白異常學說、氧化應激學說、基因突變學說、金屬離子代謝紊亂學說等，其中金屬離子代謝紊亂學說是目前研究的一個重點。鐵是人體內必不可少的微量元素，對腦的正常發育和生理功能的維持是十分重要的。當腦內缺乏鐵時會導致中樞神經遞質合成障礙和語言、運動平衡等行為學功能延遲發育[7]。當腦內鐵超載時，異常增高的腦鐵會通過以下幾個方面促進AD的發生：①促進Aβ分泌；②和Aβ結合，促進Aβ的聚集及纖維化；③和過磷酸化的Tau蛋白結合，促進神經元纖維纏結形成；④通過Fenton反應產生自由基，加劇神經元損傷。大量的臨床和基礎研究均顯示，在AD時腦組織鐵含量增高，且腦鐵升高的部位與病變累及部位一致，如海馬、皮層等鐵水平出現異常的升高[8]。同時已有研究表明腦組織內鐵含量升高程度與癡呆程度呈明顯相關性[9]。以上研究證據表明，異常增高的腦鐵參與了AD的病理過程，可能在AD發病機制中具有重要作用。因此，近些年鐵轉運相關蛋白與AD的關系是AD研究的熱點問題，鐵轉運相關蛋白包括二價金屬離子轉運體1、膜鐵轉運蛋白1、膜鐵轉運輔助蛋白、腸細胞色素b、轉鐵蛋白受體2、銅藍蛋白、血幼素、hepcidin等，其中hepcidin是近年來發現的重要鐵調節激素，是維持細胞內正常鐵代謝的重要金屬轉運蛋白，它精確調控鐵吸收、鐵儲存和鐵釋放過程[10]。hepcidin是由25個氨基酸組成的多肽，主要在肝臟合成并成熟，隨后分泌到血液中，轉運到其主要靶器官，包括小腸、肝臟、骨髓細胞和巨噬細胞，控制這些器官的鐵代謝活動[11-12]。血液中hepcidin濃度增加，將抑制小腸上皮細胞鐵吸收蛋白的表達、進而抑制小腸鐵吸收；同時增加肝臟細胞，骨髓細胞和巨噬細胞對鐵的攝取，進而增加鐵儲存和鐵利用。通過這一hepcidin介導的途徑，可有效緩解鐵超載[13]。反之，hepcidin敲除或者濃度降低，鐵的吸收會增加，而鐵的儲存和利用減少，造成鐵超載[14]。因此，hepcidin是維持細胞內正常鐵代謝的重要金屬轉運蛋白，在維持機體鐵穩態中發揮著中心作用。

AD患者腦鐵的異常積聚作為“內毒”的一種，在AD的發生發展中發揮重要作用，但目前AD患者腦鐵升高的原因還不是十分清楚[15]。中醫認為腦鐵的異常積聚是由于腎虛精虧，導致元神受抑，不能驅毒外出，兼心肝脾衰弱，致使氣血運行失常，不能使鐵毒及時、有效地清除并停留于腦內，蘊積過多而致神機受損。這與現代醫學發現的AD患者腦內某些鐵代謝相關蛋白表達失控是相一致的。再者，AD患者腎功能衰退，促紅細胞生成素(EPO)分泌不足，紅細胞生成減少，以至于鐵利用降低，造成機體儲鐵增加也是導致外周鐵代謝失衡的關鍵。因此，淫羊藿、黃芪、葛根三藥組方，具補腎健脾、生精養髓、益氣養血、滌痰化瘀、調暢氣機之功效，可扶正祛邪，使鐵毒得以清除。

因此，淫羊藿、黃芪、葛粉有效組分復方可以有效上調APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠海馬CA3區hepcidin的表達，從而減少APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠腦鐵超載，該結果提示，淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復方可以減少鐵超載而對神經元起保護作用。