積雪草酸對人舌癌TCA-8113細胞增殖、凋亡的影響

董 易，褚冬青，馬春宇，黃建華，王 一

(錦州醫科大學附屬第一醫院1. 檢驗科、2. 外科重點實驗室，遼寧 錦州 121000)

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是口腔癌中最常見的惡性腫瘤之一,與其他口腔惡性腫瘤相比，其惡性程度高，生長快，浸潤性強[1]。在過去的幾十年中，盡管對TSCC的診斷和治療取得了進展，但發病率和死亡率并沒有降低。舌癌的主要治療策略是徹底的外科手術和放化療，由于其早期癥狀不明顯，不易被發現，失去了最佳的手術治療時期，而化療藥的毒副作用較大，因此，尋找毒副作用少且對舌癌有抑制作用的藥物尤為重要。積雪草酸(asiatic acid，AA)屬于五環三萜酸，結構見Fig 1,主要來源于傘形科植物積雪草(Centella asiatica)，最早常用于促進傷口愈合。近年來，已發現AA具有許多生物活性，如抗炎護膚、保肝、降血糖、抗氧化、神經保護、心肌保護，引起了人們極大的研究興趣[2-3]。近年來一些研究顯示，AA也是促進腫瘤細胞凋亡且毒副作用小的天然產物。Wu等[4]在裸鼠成瘤模型上證實，AA可以抑制肺癌腫瘤的生長，而對正常細胞無明顯影響。AA對舌癌TCA-8113細胞的抗腫瘤作用尚未有報道，因此，本研究觀察了AA體外對舌癌TCA-8113細胞增殖、凋亡和細胞周期阻滯的影響，并探討了其可能的作用機制。

Fig 1 Chemical structural of asiatic acid

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人舌癌TCA-8113細胞，由錦州醫科大學附屬第一醫院外科重點實驗室贈予。

1.1.2藥物與試劑 AA(貨號:464-92-6,批號:JZ18030112)，購自南京景竹生物科技有限公司，純度>98%，分子式C30H48O5，分子質量488.7，溶于DMSO，DMSO終濃度小于0.1%。MTT、Hoechst 33342、二甲基亞砜(DMSO)、結晶紫(北京Solarbio公司)；胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養基(美國HyClone公司)；細胞凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；細胞周期檢測試劑盒(沈陽萬類生物科技公司)；Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；ECL Plus試劑盒(美國Thermo公司)。

1.1.3儀器 CO2培養箱(Thermo Fisher Scientific公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；倒置熒光顯微鏡(德國Leica)；流式細胞儀(美國BD Biosciences)；全自動酶標儀(美國Biotek)；MINIVE垂直蛋白電泳(美國Amersham Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 舌癌TCA-8113細胞用含10% FBS、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640,放在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2～3 d換1次液，細胞生長到皿底80%～90%時，進行傳代培養或實驗。

1.2.2MTT檢測TCA-8113細胞活力 取對數生長期TCA-8113細胞，將每孔約8×103個細胞置于96孔板中至細胞貼壁，棄舊培養液，每孔加入含不同濃度AA(0、20、30、40、50 μmol·L-1)的100 μL培養基，每組設6個復孔，培養24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)繼續培養4 h后，每孔加150 μL DMSO，酶標儀檢測490 nm處的OD值。細胞活力/%=(OD給藥組-OD空白組/OD對照組-OD空白組)×100% 。

1.2.3克隆形成實驗檢測TCA-8113細胞克隆形成 取對數生長期細胞，鋪6孔培養板，每孔細胞約1×103個，設置對照組、AA(20、30、40、50 μmol·L-1)處理組，作用時間為1周，每2 d換液1次，藥物濃度保持不變。然后用PBS輕輕漂洗2次；甲醇固定30 min，PBS輕輕漂洗3次；結晶紫染色25 min，PBS漂洗4～5次；晾干，相機拍照。

1.2.4Hoechst 33342染色觀察TCA-8113細胞凋亡形態 取對數生長期的TCA-8113細胞，6孔板中每孔約鋪1×104個細胞，培養至細胞長滿孔底80%，設對照組、AA(20、30、40、50 μmol·L-1)處理組，加入10 mg·L-1Hoechst 33342染色液(1 000 ∶1)，染色15 min后，PBS洗3次，用熒光顯微鏡(×200)觀察細胞形態，并記錄圖像。

1.2.5流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測TCA-8113細胞的凋亡率 培養細胞至對數生長期，設空白對照組、AA(20、30、40、50 μmol·L-1)處理組，作用24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，取約4×105～5×105個細胞，并在離心管中1 200 r·min-1離心5 min。用預冷PBS混勻，沖洗，取100 μL流式緩沖液重懸細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，避光4 ℃孵育15 min，再加400 μL的PBS，移入流式管中，通過流式細胞術檢測細胞凋亡率。Q1區表示壞死細胞及機械損傷細胞，Q2表示晚期凋亡細胞，Q3表示活細胞，Q4表示早期凋亡細胞。

1.2.6流式細胞術分析TCA-8113細胞周期 收集用AA處理24 h的細胞及對照組細胞，根據細胞周期檢測試劑盒的說明調整細胞密度，固定，添加RNaseA，并添加碘化丙啶染色溶液，轉移到流式管中，上機分析細胞周期。

1.2.7Western blot檢測相關蛋白表達 用AA(0、20、30、40、50 μmol·L-1)作用TCA-8113細胞24 h，細胞刮刀收集細胞，在冰盒上用細胞裂解液(裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)將細胞裂解30 min，每8 min搖動1次，4 ℃、12 000 r·min-1離心25 min。BCA蛋白試劑盒測定蛋白質濃度，制樣并在沸水中變性10 min。取蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳，電濕轉至PVDF膜，用3% BSA封閉液封閉1.5 h后，加入一抗(1 ∶1 000)4 ℃過夜，以TBST漂洗后，加入二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，用TBST沖洗3次，最后用ECL顯色試劑盒顯色。

2 結果

2.1 AA抑制TCA-8113細胞的增殖Fig 2的MTT結果顯示，隨著AA濃度的增加，人舌癌TCA-8113細胞的活力明顯降低，其作用24 h的IC50值為42.13 μmol·L-1。

Fig 2 Effect of AA on viability of TCA-8113

**P<0.01vscontrol

2.2 AA對TCA-8113細胞克隆形成能力的影響如Fig 3所示，對照組細胞克隆形成能力為100%，隨著AA濃度的增大，克隆形成能力明顯降低(P<0.01)。

Fig 4 Effect of AA on nuclear morphology change of TCA-8113 cells(×200)

2.3 AA對TCA-8113細胞凋亡的影響Hoechst 33342染色時，在熒光顯微鏡下觀察到正常細胞核顯示出弱的藍光，而凋亡細胞核顯示出致密的亮藍色熒光。如Fig 4所示，對照組TCA-8113細胞核呈微弱熒光，隨著AA濃度的增大，細胞核的藍色熒光致密且亮，與AA濃度呈正比。流式細胞儀結果如Fig 5所示，AA(20、30、40、50 μmol·L-1)逐漸誘導TCA-8113細胞的凋亡。

2.4 AA阻滯TCA-8113細胞周期于G2/M期流式分析細胞周期分布情況，檢測細胞周期改變是否參與AA誘導TCA-8113細胞凋亡的過程。Fig 6、Tab 1結果顯示，不同濃度AA作用24 h后，TCA-8113細胞在G2/M期明顯停滯(P<0.05)。

2.5 AA對TCA-8113細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3表達的影響如Fig 7所示，與對照組相比，AA組Bcl-2表達降低，而Bax、cleaved caspase-3蛋白水平均明顯增加，具有一定程度的濃度依賴性(P<0.01)。

Tab 1 Cell cycle analysis of TCA-8113 cells treated with AA for 24 n=3)

*P<0.05vscontrol group

2.6 AA促進TCA-8113細胞中p53信號通路的激活如Fig 8所示，AA呈濃度依賴性增加p53、p21蛋白的表達(P<0.05)。

3 討論

TSCC是全球口腔癌中發病率和死亡率的主要原因，全世界約50%的舌癌患者存在晚期疾病, 經手術完整切除后，癌癥仍有復發和轉移的可能性，嚴重影響了患者的生活質量。因此，如何抑制舌鱗癌的增殖、誘導其凋亡，是目前抗腫瘤治療的熱點問題。AA可抑制各種腫瘤細胞，如乳腺癌、卵巢癌、結腸癌和肺癌的增殖和分化。然而，特異性抗癌機制非常復雜，涉及線粒體凋亡和細胞周期分布。Aktarul等[5]研究表明，在大鼠結腸癌模型中，AA能抑制癌前病變、炎癥、細胞增殖和誘導細胞凋亡，而對結腸黏膜細胞無毒性作用。Chen等[6]研究表明，AA能抗順鉑引起的急性腎損傷，對小鼠的正常細胞無影響。以上研究結果說明，AA有可能作為低毒高效的抗腫瘤藥物應用。本研究利用不同濃度的AA處理人舌癌TCA-8113細胞，MTT結果顯示，其IC50值為42.13 μmol·L-1，確定了后續實驗所用AA濃度(20、30、40、50 μmol·L-1)，即達到了抑制腫瘤細胞增殖和促進凋亡的效果，又不會產生毒副作用。此外，AA處理的舌癌細胞的克隆生長被阻斷，進一步證實了AA的抗腫瘤活性，但其作用機制不明。

Fig 5 Effect of AA on apoptosis of TCA-8113 *P<0.05,**P<0.01 vs control

Fig 6 Cell cycle distribution of TCA-8113 cells after treatment with AA for 24

Hoechst 33342染色是觀察AA誘導細胞凋亡變化的最直觀方法。隨著AA濃度的增高，舌癌TCA-8113細胞體積大小不一，細胞核或細胞質呈致密濃染的顆粒狀熒光，在凋亡細胞中，清楚地觀察到具有高藍色熒光強度的凋亡小體。通過流式細胞術檢測AA作用于舌癌TCA-8113細胞后熒光強度，反映凋亡情況，實驗結果顯示，AA處理TCA-8113細胞24 h后，細胞凋亡率逐漸增加，最高可達79.42%。

細胞凋亡主要表現為核凝聚和碎裂，凋亡小體出現，未見質膜破裂。目前，已知腫瘤細胞凋亡通路有多種，主要依賴線粒體通路和凋亡受體通路兩種方式。在細胞凋亡過程中，許多凋亡信號匯聚于線粒體，Bcl-2家族成員通過整合凋亡信號，使細胞色素C釋放，協調caspase-3激活，從而使線粒體外膜的通透性增加[7]。p53蛋白分子作為轉錄因子，能夠上調Bax的表達，從而對抗Bcl-2的抗凋亡作用[8]。Bcl-2族系的凋亡相關蛋白，如Bcl-2、Bax、Bcl-xl都錨定于線粒體膜中，它們能阻止或促進細胞色素C的釋放，進而影響細胞的程序性死亡[9-10]。Bax表達增加能夠促進細胞色素C釋放到細胞質中，而Bcl-2抗凋亡蛋白能夠保持線粒體完整性來阻止細胞色素C的釋放。因此，Bcl-2蛋白表達降低有利于細胞色素C從線粒體中釋放出來，有助于caspase-3激活，活化的caspase-3被認為是細胞凋亡的生物標記物[11]。本研究Western blot結果顯示，AA抑制Bcl-2表達的同時，增加Bax的表達，導致caspase-3表達增加，且呈濃度依賴性。

Fig 7 Effect of AA on expression of Bax, Bcl-2 and cleaved caspase-3 in TCA-8113

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 8 Effect of AA on expression of p53 and p21

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

細胞周期控制是一個高度調控的過程，涉及一系列復雜的信號，大多數癌細胞在G1檢查點發生分裂，導致依賴G2檢查點來調節細胞復制。正常細胞依靠G1檢查點來保護自己免受DNA損傷。因此，影響G2/M細胞周期的藥物對正常細胞的危害較小[12]。p53作為一種腫瘤抑制蛋白，通過誘導p21依賴性細胞周期阻滯或凋亡，來控制細胞對刺激因素應激的長期反應[13]。本實驗通過流式細胞術分析舌癌TCA-8113細胞的細胞周期，不同濃度的AA作用TCA-8113細胞24 h后，細胞周期在G2/M期逐漸被阻斷，且呈濃度依賴性。此外，我們檢測了p53及p21的表達，發現在AA處理后p53和p21上調。這些數據表明，AA誘導的G2/M期阻滯與p53、p21上調有關。這與Hsu等[14]報道的AA可以誘導人乳腺癌細胞阻滯在S-G2/M期，以及Zhang等[15]發現在多發性骨髓瘤RPMI 8226細胞中，AA處理也導致G2/M期阻滯相一致。

綜上所述，本研究表明，AA抑制舌癌TCA-8113細胞的增殖作用主要通過誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯在G2/M期來完成。AA誘導TCA-8113細胞凋亡的機制可能與調控p53通路相關蛋白p53、p21、Bax及抑制Bcl-2有關。隨后的實驗將探索AA抑制細胞增殖和動物實驗的更多分子機制。