長江口表層沉積物中合成聚酯降解菌的多樣性研究?

劉 欣， Patrick HILLE， 鄭明剛， 高 萍， 尚 琨， 韋 韌， 劉同軍， 曲凌云

(1.齊魯工業大學，山東 濟南 250353； 2．自然資源部第一海洋研究所，山東 青島 266061； 3．萊比錫大學，德國 Leipzig 04103； 4. 大連海洋大學水產與生命學院，遼寧 大連116023)

海岸帶及海洋環境中的塑料污染已經成為全球環境問題。Jenna R. Jambeck等[1]估算出2010年全球192個沿海國家和地區共產生塑料垃圾2.75億t，其中有4.8～12.7萬t通過不同的途徑流入海洋，而這個數量還在持續增加。預計至2025年，全球海洋中塑料垃圾量將高達2.5億t，其中絕大部分塑料難于或無法被降解而長期存在于環境中。海洋環境中的塑料一方面通過誤食、纏繞等方式對浮游動物和底棲生物產生危害；另一方面通過表面富集金屬物質、持久性有機污染物(POPs)，如多氯聯苯(PCBs)、多環芳香烴(PAHs)、滴滴涕(DDTs)以及其他有機氯農藥，作為污染物載體影響海洋生態系統的健康和持續發展[2-4]。

為解決和減輕塑料污染等一系列環境問題，可生物降解塑料的研究成為一個新的研究熱點。聚己內酯(Polycaprolactone，PCL)是一類化學合成的高分子材料，它是以二元醇為反應開始劑，通過ε-己內酯開環聚合生成的產物。由于PCL的熔點較低且具有較好的生物降解性能和生理相容性而被廣泛應用，成為一種獲得美國FDA批準的完全生物降解材料[5]。三丁酸甘油酯(Tributyrin)天然存在于牛脂中，工業應用主要是人造黃油的加工和作為飼料添加劑。在生物科技中作為篩選、表征酯酶的底物。除此之外，Tributyrin還可以被添加在聚羥基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate, PHB)中起到增塑劑作用，并可以改變PHB的可生物降解性[6]。但目前，國內外關于生物降解塑料的研究大多側重于材料的改性以提高降解效果而較少從微生物角度進行塑料降解的研究。

PCL、Tributyrin等在自然界的生物降解主要由微生物參與[8]。人們對PCL生物降解的認識起源于1970年代，Tokiwa Y等分離得到第一株可降解ε-PCL的微生物，經鑒定為Penicilliumsp.[8]。2011年，Sekiguchi T等在深層海洋中分離出5株耐低溫、耐高壓的PCL降解菌株，分別為Alcanivorax(1株)，Tenacibaculum(1株)，Pseudomonas(3株)[9]。2012年，Li等[10]從土壤中篩選出 1 株 PCL 降解菌PenicilliumoxalicumDSYD05-1，且對 PCL有著較高的降解效率。有研究報道稱已從土壤中篩選出 1 株以PCL為唯一碳源的嗜熱菌株Streptomycesthermoviolaceussubsp．76T-2，該菌株在 45 ℃環境下培養6 h，可將培養基中的 PCL 完全降解[11]。從不同自然環境篩選可降解PCL、Tributyrin等材料的菌株，有助于研究微生物降解不同酯類底物的特性和規律，也可為類比評估其他聚酯類可生物降解塑料的應用和污染防控提供參考。

河流入海口是陸地和海洋相互作用的交界地區，也是人類活動產生的大量塑料垃圾輸送入海的必經之地[12]，但目前對這一生境中塑料降解菌的研究極少。本研究以中國長江入海口臨近海域表層沉積物中的微生物為研究對象，篩選具有降解PCL和Tributyrin活性的菌株，并評估其多樣性，為揭示海洋沉積物中塑料垃圾的微生物降解機制、開發利用海洋中塑料解聚酶等提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品 實驗所用菌種為2017年2、5、7、9月從長江口27個站位表層沉積物中分離獲得，保藏于本實驗室。

1.1.2 培養基

(1)2216E 培養基(g/L) 酵母提取物 5 g、胰蛋白胨10 g、瓊脂20 g、陳海水，PH調至7.6～7.8，121 ℃高壓滅菌20 min。

(2)PCL固體培養基(g/L) 酵母提取物 5 g、胰蛋白胨10 g、瓊脂20 g、PCL 0.5 g、丙酮100 mL、陳海水 1 L。PCL用丙酮于50℃溶解，每0.5 g PCL加入丙酮100 mL。除PCL溶液外，其余試劑加入培養基，0.1 MPa滅菌20 min后用磁力攪拌器攪拌，同時加入溶解好的PCL。

(3)增塑劑固體培養基(g/L) Tributyrin(增塑劑) 10 mL、酵母提取物 5 g、胰蛋白胨10 g、瓊脂20 g、陳海水1 L。除Tributyrin外，其余試劑加入培養基，0.1 MPa 滅菌20 min；待培養基滅菌后冷卻至70 ℃左右加入Tributyrin，每100 mL 培養基加入Tributyrin 1 mL。劇烈震蕩并于70 ℃超聲5 min。

1.2 方法

1.2.1 酯類降解菌降解活性的測定 將篩選出的可降解PCL和Tributyrin的菌株分別接種于含PCL和Tributyrin的固體培養基上，30 ℃培養4～5 d，肉眼觀察，測量透明圈直徑和菌落直徑。

1.2.2 16S rRNA 基因的擴增與序列分析

(1)16SrRNA 基因模板的制備 用滅菌的槍頭挑取單菌落于38 μL 無菌水中混勻。置于PCR 儀，99 ℃ 20 min。

(2) PCR 擴增所用引物 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492rrrr(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR 反應體系(60 μL)：Premix TaqTM30 μL，引物各3 μL，模板菌3 μL，無菌水補足至60 μL。PCR 反應條件：95℃ 5 min；94℃45 s，60 ℃45 s，72 ℃90 s，35 個循環；72 ℃ 10 min。PCR 產物送至上海生工生物科技有限公司測序。

(3) 將所測菌株的16SrRNA 基因序列通過EzBioCloud 數據庫(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)進行比對。一般認為，16S rRNA 基因序列相似性大于98.65%，可以認為是同1個種，同源性小于98%可以認為是不同的種，小于95%可以認為是不同的屬。并將獲得的16S rRNA 基因序列提交到NCBI 進行序列號的注冊。

1.2.3 系統發育學分析 通過MEGA 7.0及鄰接法(Neighbor-Joining)對相似度最高的基因序列建立系統發育樹，通過自展分析(Boot strapping)進行系統發育樹的評估，自展數據集為1 000 次。

1.2.4 多樣性分析 以種為分類水平，分別計算不同類型合成聚酯及不同采樣時間的合成聚酯降解微生物的Shannon指數和Simpson指數：

Shannon-Wiener 多樣性指數[17]計算公式：

H=-∑(Pi)(log2Pi)，Pi=ni/N。

Simpson 相遇指數計算公式：

D=1-∑(ni/N)2。

式中，ni=群落中第i個種的個體數量。

2 結果與分析

2.1 PCL、Tributyrin降解菌株的數量分布

從長江口表層沉積物4個月份樣品中獲得合成聚酯降解菌480株，其中僅降解Tributyrin 34株，占比7.08%；僅降解PCL 1株；能同時降解PCL和Tributyrin 445株，占比92.71%。

2.2 PCL、Tributyrin降解細菌的16S rRNA 基因序列分析

將菌株的 16S rRNA 基因序列進行EzBioCloud比對分析，根據同源性比對結果確定所獲得的合成聚酯降解細菌分屬于14個屬50種，不同種合成聚酯降解菌代表菌株序列比對結果見表1～3。

2.3 PCL、Tributyrin降解菌降解能力的測定

降解PCL和Tributyrin的菌株在PCL、Tributyrin固體培養基上形成的透明圈直徑(D)與菌落生長直徑(d)的比值(D/d)是評估PCL和Tributyrin降解能力的指標之一，可初步判別菌株降解PCL和Tributyrin的能力。本實驗選取直徑比(D/d)大于 1.5 的菌株作為降解能力較好的菌株。PCL和Tributyrin降解菌在平板上的降解現象見圖2，所獲得的降解能力較好的菌株列于表4、5。由結果可知，有131株Tributyrin降解菌株形成的透明圈直徑(D)與菌落生長直徑(d)的比值均大于1.5，其中從2、5、7、9月獲得的菌株數分別為43、16、25、47株；有29株PCL降解菌株形成的透明圈直徑(D)與菌落生長直徑(d)的比值均大于1.5，其中從2、5、7、9月獲得的菌株數分別為7、10、3、9株。

(T:三丁酸甘油醋降解菌 Tributyrin；P：聚己內醋降解菌 PCL degrading bacteria)

圖1 長江口沉積物四個月份不同類型 合成聚酯降解菌數量比例圖
Fig.1 Proportions of polyester degrading bacteria for degrading different substrates from sediments in the Yangtze River Estuary isolated in four months

表1 只降解Tributyrin菌株16S rRNA 基因序列比對結果Table 1 The 16S rRNA gene comparison results of tributyrin degradingbacteria

表2 同時降解PCL、Tributyrin菌株16S rRNA 基因序列比對結果Table 2 The 16S rRNA gene comparison results of bacteria able to degrade both PCL and tributyrin

表3 只降解PCL菌株16S rRNA 基因序列比對結果Table 3 The 16S rRNA gene comparison results of PCL degrading bacteria

2月Tributyrin降解菌有10種菌直徑比大于1.5，5種屬于Psychrobacter、3種屬于Bacillus，另外兩種分別屬于Brevibacterium和Pseudoalteromonas； PCL降解菌有3種菌直徑比大于1.5，2種屬于Psychrobacter，另外一種屬于Bacillus；5月Tributyrin降解菌有8種菌直徑比大于1.5，5種屬于Bacillus，另外3種分別屬于Exiguobacterium、Fictibacillus、Vibrio屬； PCL降解菌有8種菌直徑比大于1.5，7種屬于Bacillus，另外一種屬于Vibrio；7月份有6種菌直徑比大于1.5，6種都屬于Vibrio； PCL降解菌有1種菌直徑比大于1.5，屬于Vibrio；9月份Tributyrin降解菌有9種菌直徑比大于1.5，6種屬于Vibrio，2種屬于Exiguobacterium，另一種屬于Glechoma； PCL降解菌有3種菌直徑比大于1.5，2種屬于Vibrio；另一種屬于Exiguobacterium。所獲得降解菌株中降解能力較好的菌株主要集中在Psychrobacter、Bacillus和Vibro屬。這些菌株降解效果優于其他菌株，可為下一步的研究提供優質菌種資源。

(T:三丁酸甘油醋降解菌 Tributyrin；P：聚己內醋降解菌 PCL degrading bacteria)

圖2 PCL和Tributyrin固體培養基上產生的透明圈
Fig.2 Clear lysis zones on PCL and tributyrinplates

表4 直徑比(D/d)比大于1.5的Tributyrin降解菌Table 4 Tributyrin degrading bacteria with a ratio between the clear zone diameter (D) and the colony diameter (d) of greater than 1.5

續表4

代表菌株編號No.分離月份Separationmonth相似菌株Similar straing相似度Similarity /%菌株數Number of bacteria 直徑比Diameterratio201705CJKOP-105Bacillus megaterium NBRC 15308(T)99.7211.600201705CJKOP-115Vibrio hyugaensis 090810a(T)100.0041.556201705CJKOP-94Fictibacillus halophilus AS8(T)99.5811.500201707CJKOP-Y1777月Vibrio fluvialis NBRC 103150(T)99.3832.400201707CJKOP-57Vibrio alginolyticus NBRC 15630(T)99.2811.800201707CJKOP-Y27Vibrio furnissii CIP 102972(T)99.4541.600201707CJKOP-Y45Vibrio atypicus HHS02(T)99.2911.583201707CJKOP-Y1Vibrio neocaledonicus NC470(T)99.43152.670201707CJKOP-Y150Vibrio antiquarius Ex25(T)99.2411.500201709CJKOP-229月Glechoma hederacea98.2112.222201709CJKOP-5Exiguobacterium profundum 10C(T)99.1821.900201709CJKOP-57Vibrio neocaledonicus NC470(T)99.86311.800201709CJKOP-33Vibrio coralliilyticus ATCC BAA-450(T)97.1831.800201709CJKOP-9Vibrio hyugaensis 090810a(T)99.3521.667201709CJKOP-64Vibrio crassostreae LGP7(T)99.6631.583201709CJKOP-51Vibrio antiquarius Ex25(T)99.3111.500201709CJKYOP-55Vibrio campbellii CAIM 519(T)99.0021.500201709CJKOP-64Exiguobacterium mexicanum 8N(T)98.3721.500

表5 直徑比(D/d)大于1.5的PCL降解菌Table 5 PCL degrading bacteria with a ratio (D/d) between the clear zonediameter (D) and the colony diameter (d) of greater than 1.5

2.4 多樣性分析

以種為分類地位計算不同類型材料及不同采樣時間的合成聚酯降解微生物的Shannon指數和Simpson指數(見表7)，結果表明長江口鄰近海域27個站位的表層沉積物在2、5月份合成聚酯降解微生物的種類更豐富；Tributyrin降解菌的物種豐富度高于PCL降解菌的物種豐富度。

表6 不同季節可培養降解合成聚酯細菌生物多樣性Table 6 The diversity of culturable polyester degradingbacteria in different season

表7 降解不同合成聚酯的可培養細菌生物多樣性Table 7 The diversity of culturable polyester degrading bacteria

2.5 系統發育分析

通過擴增獲得的 16S rRNA 基因序列在EzBioCloud 進行序列比對，將只能降解Tributyrin和可同時降解PCL和 Tributyrin的細菌分別構建系統發育樹(見圖3、4)。由結果可知，18種只降解Tributyrin和31種同時降解PCL和Tributyrin的細菌均聚類于Firmicutes、Proteobacteria。

(自展數據集為1 000次。括號內為GenBank 登錄號；分支上的數字為自展值百分比；線段0.05 為核苷酸替換率。The bootstrap data set is 1 000 times. Numbers in parentheses represent the sequences’ accession number in GenBank; The number at each branch point is the percentagesupported by bootstrap; Bar: 0.05 substitutions per nucleotide position.)

圖3 根據 16S rRNA 基因序列構建的18 種只降解Tributyrin細菌的系統發育樹
Fig.3 NJ phylogenetic tree of 18 onlydegrading Tributyrin bacteria based on 16S rRNA gene sequences

2.6 PCL、Tributyrin降解菌的種群分布

圖5顯示2017年長江口表層沉積物中4個月份PCL和Tributyrin降解菌各屬細菌數量。4個月份樣品獲得的PCL和Tributyrin降解菌分屬于14個不同的屬：其中只能降解Tributyrin的34株菌分屬于Psychrobacter、Bacillus、Exiguobacterium、Fictibacillus、Oceanobacillus、Paenibacillusr、Vibrio、Brevibacterium、Chromohalobacter、Staphylococcus10個不同的屬，優勢屬為Vibrio；只降解PCL的1株菌分屬于Kocuria。能同時降解PCL和Tributyrin的445株菌分屬于Psychrobacter、Bacillus、Brevibacterium、Pseudoalteromonas、Vibrio、Staphylococcus、Photobacterium、Glechoma、Exiguobacterium8個不同的屬，優勢屬為Vibrio；Psychrobacter次之。4個月份降解PCL和Tributyrin的菌種，大部分集中于Psychrobacter、Vibrio兩個屬，且Vibrio為優勢屬。

(自展數據集為1 000次。括號內為GenBank 登錄號；分支上的數字為自展值百分比；線段0.05 為核苷酸替換率。The bootstrap data set is 1 000 times. Numbers in parentheses represent the sequences’ accession number in GenBank; The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap; Bar: 0.05 substitutions per nucleotide position.)

圖4 根據 16S rRNA 基因序列構建的31種同時降解PCL和Tributyrin細菌的系統發育樹
Fig. 4 NJ phylogenetic tree of 31 degrading PCL and Tributyrin bacteria based on 16S rRNA gene sequences

(T:三丁酸甘油醋降解菌 Tributyrin；P：聚己內醋降解菌 PCL degrading bacteria)

圖5 長江口沉積物四個月份各屬降解合成聚酯細菌數量對比圖
Fig.5 The amount of polyester degrading bacterial strains, isolated in different months from sediments in the Yangtze River Estuary, and their genus affiliations

圖6顯示2017年長江口表層沉積物不同時間PCL和Tributyrin降解菌株各屬細菌數量。其中，2月僅能降解Tributyrin的菌株包括Psychrobacter、Bacillus、Exiguobacterium、Fictibacillus4個不同的屬，優勢屬為Psychrobacter；能同時降解PCL和Tributyrin的菌株包括Psychrobacter、Bacillus、Brevibacterium、Pseudoalteromonas4個不同的屬，優勢屬為Psychrobacter。5月僅能降解Tributyrin的菌株包括Oceanobacillus、Bacillus、Brevibacterium、Exiguobacterium、Fictibacillus、Paenibacillus、Psychrobacter、Vibrio8個不同的屬，優勢屬為Bacillus；僅能降解PCL為Kocuria一個屬；能同時降解PCL和Tributyrin的菌株包括Bacillus、Vibrio2個不同的屬。7月僅能降解Tributyrin的菌株包括Chromohalobacter、Vibrio2個不同的屬，優勢屬為Vibrio；能同時降解PCL和Tributyrin的菌株包括Vibrio、Staphylococcus、Photobacterium3個不同的屬，優勢屬為Vibrio。9月僅能降解Tributyrin的菌株包括Vibrio、Exiguobacterium、Staphylococcus3個不同的屬，優勢屬為Vibrio，6株;能同時降解PCL和Tributyrin的菌株包括Vibrio、Glechoma、Exiguobacterium、Bacillus4個不同的屬，優勢屬為Vibrio。

(T:三丁酸甘油醋降解菌 Tributyrin；P：聚己內醋降解菌 PCL degrading bacteria)

圖6 長江口沉積物不同月份各屬降解合成聚酯細菌數量對比圖
Fig.6 The amount of polyester degrading bacterial strains, isolated in fourmonths from sediments in the Yangtze River Estuary, and their genus affiliations

同一取樣時間獲得的菌株中，PCL和Tributyrin降解菌種屬存在差異，但優勢屬均相同。不同時間PCL和Tributyrin降解菌的優勢屬均不相同，2、5、7、9月份的優勢屬分別為Psychrobacter、Bacillus、Vibrio、Vibrio。不同的生態環境特征是造成細菌群落結構和多樣性的最主要原因,長江口海域主要受長江沖淡水和臺灣暖流等不同性質水團的共同影響，在不同季節通過自身特征的變化影響微生物群落結構[13]。張東聲[14]發現長江口及鄰近海域沉積物中細菌具有較高的多樣性，主要包括變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、和熱袍菌門(Thermotogae)。其中，變形菌門(Proteobacteria)為優勢類群，占比42.7%；其次為酸桿菌門(Acidobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)，分別占比17.8%和7.2%。其中，冬季和夏季的優勢類群均為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)。由本文分析結果可得PCL和Tributyrin降解菌均聚類于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)，分別為385、85株。其中，冬季、夏季和秋季的優勢類群均為變形菌門(Proteobacteria)。由此表明，變形菌門(Proteobacteria)在長江口沉積物中占據優勢地位，同時也是長江口沉積物中降解塑料微生物的重要組成部分。

3 討論

已見于文獻報道具有PCL降解活性的微生物有Bacillus、Pseudoalteromonas、Penicillium、Shewanella、Psychrobacter、Thermophilus等[7-8,10,15]。本研究從海洋環境中分離出多種PCL降解菌株，經鑒定為Brevibacterium、Exiguobacterium、Vibrio、KocuriaStaphylococcus、Photobacterium、Pseudoalteromonas、Psychrobacter。其中，Bacillus[16]、Pseudoalteromonas[9]、Psychrobacter[17]已有前人分離研究過，而Brevibacterium、Exiguobacterium、Vibrio、Kocuria、Staphylococcus、Photobacterium還未有PCL降解活性的相關報道，且其降解透明圈最大直徑比(D/d)都在1.5以上，均為具有潛力的PCL降解菌株，這將為海岸帶及海洋環境中塑料降解提供新的微生物資源。

微生物在降解PCL時主要是通過分泌胞外PCL水解酶，將高分子降解為小分子然后將小分子單體轉運到胞內，再通過其他生化反應將其降解為水、二氧化碳、甲烷、以及其它無毒無害的自然物質[18]。目前，對PCL解聚酶的研究還不多，在PCL降解過程中，可能有兩種類型的酯酶。已報道的PCL解聚酶主要屬于脂肪酶[19-20]，或者屬于角質酶[18]。Tokiwa等[21]在1977年純化出的PCL降解菌株Penicilliumsp.的胞外酶和OdaY等[19]純化出的Alcaligenesfaecalisde的胞外解聚酶都被鑒定為脂肪酶。Sonˇa Hermanov[16]等利用枯草芽孢桿菌產生的脂肪酶降解PCL，將該菌株在 30 ℃環境下培養14天，可將培養基中的 PCL 降解10%。本研究篩選出的Bacillus、PsychrobacterPCL降解菌的最大直徑比(D/d)依次為3.2、3.25，具有較高的的PCL降解活性，可推斷本研究篩選的PCL降解菌是通過分泌某種胞外酶可降解PCL，但其降解特性和降解機制有待進一步探討。

在PCL降解過程中，會伴隨著PCL質量損失、表面形態、結晶度等理化性質的改變。在PCL降解過程中，PCL的晶體結構均受到一定程度的破壞，結晶度都有所降低[22]。Sekiguchi T[9]等在日本淺灘分離出一株降解PCL的假單胞菌，用PCL纖維的強度保持率和纖維的表面形態表征該菌株對PCL的降解能力。經假單胞菌處理1周后，PCL纖維的強度保持率下降到78%，纖維表面變得非常粗糙。因而通過研究降解前后PCL質量損失、表面形態、結晶度等理化性質的改變，有利于推測微生物對PCL的生物降解的效果。本研究下一步將以PCL為碳源，監測PCL降解過程中PCL相關理化性質的改變，另外通過酶學和基因組學研究深入探討海洋細菌降解塑料的途徑和機制。