冰片配伍黃芪甲苷與三七總皂苷對腦缺血/再灌注后血腦屏障通透性的影響

丁 煌，唐 三，楊筱倩，劉曉丹，黃小平，鄧常清

(湖南中醫(yī)藥大學分子病理實驗室，中西醫(yī)結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，長沙 410208)

血腦屏障(blood brain barrier,BBB)是介于血液和腦組織間對物質通過具有選擇性的動態(tài)界面，主要由血管內皮細胞、緊密連接(tight junctions，TJs)、基底膜、周細胞以及星形膠質細胞終足共同構成[1]。TJs是BBB的結構和功能基礎，存在于相鄰血管內皮細胞之間，主要由閉合蛋白(Claudin)、咬合蛋白(Occludin)和連接黏附分子三種跨膜蛋白組成[2]。它們通過閉鎖小帶蛋白(zonula cccludens，ZO)與血管內皮細胞骨架相連，并能識別TJs位置及傳遞各類信號。緊密連接蛋白表達減少會破壞TJs整體性，進而破壞BBB，導致腦水腫和腦損傷[3]。腦缺血后，可導致BBB的破壞，血管壁通透性增加[4]。

黃芪和三七是治療心腦血管疾病的常用中藥，黃芪總苷(astragalosides，AST)是黃芪中的主要藥效組分，主要含黃芪甲苷(astragalosides Ⅳ，AST Ⅳ)；三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是三七的主要藥效組分，主要含人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1等。冰片是小分子脂溶性單萜類化合物，既可促進藥物透過BBB，又能維持BBB結構的完整性，并降低其通透性，從而對BBB及腦組織起到保護作用[5]。我們根據中藥歸經理論，將冰片與AST Ⅳ和PNS配伍后，可促進AST Ⅳ、Rg1、Rb1和R1吸收入腦，增加藥物成分在腦組織的富集[6]。由于腦缺血可導致BBB破壞、血管壁通透性增加，而BBB的通透性增加又可以促進藥物成分進入腦組織，本研究的主要目的是探討冰片“引藥上行”促進AST Ⅳ與PNS有效成分入腦的作用是否與BBB的破壞和開放有關，對BBB的結構和受損的腦組織又起怎樣的作用，從而為冰片配伍AST Ⅳ與PNS抗腦缺血作用的合理應用與開發(fā)提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑冰片(左旋龍腦，主要成分為1，7-三甲基-二環(huán)庚-2-醇，含量86%，購自湖北俊輝有限公司，批號20170815)；AST Ⅳ(純度≥98%，批號MUST-17022804)；PNS(純度≥98%，批號MUST-17060601)、人參皂苷Rg1(純度≥98%，批號MUST-17030829)、Rb1(純度≥98%，批號MUST-17022510)和三七皂苷R1(純度≥98%，批號MUST-17071228)均購自成都曼思特生物科技有限公司，藥物用時以0.5%羧甲基纖維素鈉配置成相應濃度混懸液。依達拉奉注射液購自南京先聲東元制藥有限公司生產，批號80-090104，規(guī)格每支10 mg(5 mL)。

二甲基砷酸鈉(Sigma公司，批號C0250)、戊二醛溶液(上海麥克林生化科技有限公司，批號G810413)、硝酸鑭(上海麥克林生化科技有限公司，批號L812372)、Claudin5兔單克隆抗體(英國abcam公司，批號ab131259)、Occludin兔單克隆抗體(英國abcam公司，批號ab167161)、ZO-1兔單克隆抗體(美國proteintech公司，批號21773-1-AP)、ZO-2兔單克隆抗體(美國proteintech公司，批號18900-1-AP)、β-actin兔多克隆抗體(美國ABclonal公司，批號AC026)、 HRP標記的山羊抗鼠二抗(美國proteintech公司，批號SA00001-1)、HRP標記的山羊抗兔二抗(美國proteintech公司，批號SA00001-2)，RIPA裂解液(康為世紀生物科技有限公司，批號cw2333s)、ECL化學發(fā)光液(北京鼎國昌盛生物科技有限公司，批號GE2301)、蛋白Marker(美國Thermo fisher，批號515683)、BCA試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號K176810E)。

1.2 動物SPF級♂ Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量(200～250) g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供(動物合格證號：No.43004700037715)。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心(場地許可證號：SKY(湘)2013-0005)。實驗前適應性喂養(yǎng)(5～7) d，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.3 儀器透射電鏡(日本，日立HT7700)，高速冷凍離心機(YINGTAI，TGL20)，酶標儀(美國，ELX800)，電泳儀(美國Bio-Rad公司，041BR132283)，蛋白轉膜槽(美國Bio-Rad公司)，化學發(fā)光凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司，ChemiDoC XRS+)。

2 方法

2.1 大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注模型制作采用前期方法[7]制作MCAO局灶性腦缺血模型，阻斷2 h后，拔出線栓進行再灌注22 h。

2.2 給藥、取材根據我們前期實驗結果[8]，將動物隨機分為：假手術組、模型組、單用冰片(15 mg·kg-1)組、單用AST Ⅳ(20 mg·kg-1)組、單用PNS(50 mg·kg-1)組、AST Ⅳ(20 mg·kg-1)+PNS(50 mg·kg-1)組、冰片(15 mg·kg-1)+AST Ⅳ(20 mg·kg-1)+PNS(50 mg·kg-1)組及依達拉奉4 mg·kg-1組，每組5只大鼠。各中藥組于造模前2 d開始灌胃，每天兩次，兩次給藥間隔12 h。依達拉奉組進行腹腔注射，每天1次。假手術組及模型組灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉。于給藥d 3灌胃1 h后行缺血2 h，再灌注22 h，術后繼續(xù)同前給藥，再灌注結束后處死動物，做相應指標檢測。

2.3 神經功能評分大鼠再灌注22 h后，取材前按前法[7]進行神經功能評分。評分越高，表明神經功能損傷越嚴重。

2.4 血腦屏障通透性檢測(鑭示蹤電鏡)

2.4.1取材 再灌注結束后取材。腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL·kg-1)麻醉大鼠，暴露心臟剪開右心耳，將灌注用針從心尖插入左心室，注入生理鹽水，至動物出現肝臟、肺變白及右心房流出澄清液體后，灌注鑭醛固定液200 mL(4.28 g二甲基砷酸鈉，溶于40.8 mL的0.2 mol·L-1鹽酸，定容至400 mL，配成二甲基砷酸鈉溶液；再稱取20 g多聚甲醛，溶解于60 ℃ 500 mL超純水，倒入20 mL 50%戊二醛溶液及80 mL二甲基砷酸鈉溶液，調pH值至7.4，加入20 g硝酸鑭，定容至1 L即得)至動物全身僵硬，斷頭取患側大腦置鑭醛固定液中保存。

2.4.2鑭電鏡檢測 取固定后的右腦切至1×1×3 mm3，用0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗3次，每次10～15 min，1%鋨酸固定液固定1～2 h，0.1 M磷酸漂洗液漂洗3次每次10～15 min后，脫水處理：50%丙酮10～15 min，70%丙酮10～15 min，90%丙酮10～15 min，100%丙酮15～20 min，純丙酮+包埋液(1 ∶1)37 ℃12 h，純包埋液37 ℃ 10～12 h，37 ℃烘箱內過夜。再將腦組織60 ℃烘烤12～24 h，超薄切片至50～100 nm，3%醋酸鈾以及硝酸鉛雙染，置于日立HT7700透射電鏡觀察、拍片。鑭顆粒為重金屬，不易通過BBB，當BBB完整性破壞時，鑭從毛細血管漏出，且被示蹤在腦毛細血管的周圍組織，故可用鑭示蹤法評價BBB完整性。

2.5 腦含水量測定(干濕重法)斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干等部位，分離雙側大腦半球，立即置電子天平測定腦組織濕重[室溫(20～25)℃，濕度60%～75%]，然后將腦組織于80 ℃烤2 d以上至恒重，測定腦組織干重(兩次測定值之差小于0.2 mg)。腦含水量/%=(濕重-干重)/濕重×100%[9]。

2.6 腦組織ZO-1、ZO-2、Claudin5、Occludin蛋白的定位及定量檢測(免疫組織化學染色法)取患側視交叉后2～6 mm腦組織，冠狀切開，迅速置于4%多聚甲醛溶液固定。石蠟包埋后切片，片厚4 μm。進行免疫組化染色測定，ZO-1單克隆抗體、ZO-2單克隆抗體、Claudin5單克隆抗體及Occludin單克隆抗體分別作1 ∶500稀釋。每張切片在顯微鏡(10×40)下隨機選取皮質區(qū)5個有毛細血管的視野，觀察ZO-1、ZO-2、Claudin5、Occludin蛋白沿毛細血管分布情況，棕色顆粒即為陽性表達。Image pro-plus軟件測定每個視野下每個血管壁上棕色顆粒的光密度(optical density，OD)值，計算平均值，代表相應蛋白表達量。

2.7 腦組織ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin5蛋白表達(Western blot法)取患側視交叉后2～6 mm腦組織50 mg，加入1 mL預冷的RIPA，冰上勻漿，靜置20 min后12 000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清，BCA試劑盒測定總蛋白含量。每個樣本取80 μg蛋白，100℃水浴10 min變性，110 V恒壓電泳90 min，200 mA轉膜2 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，再分別與ZO-1抗體(1 ∶500)、ZO-2抗體(1 ∶500)、Claudin5抗體(1 ∶5 000)、Occludin抗體(1 ∶10 000)、β-actin抗體(1 ∶8 000)孵育，4 ℃靜置過夜，TBST洗3次，每次10 min；然后分別加羊抗兔二抗(1 ∶5 000)或羊抗小鼠二抗(1 ∶8 000)，于37 ℃孵育1 h或常溫水平搖床上孵育2 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，加ECL化學發(fā)光劑于凝膠成像儀中顯影。用Image Lab圖像分析軟件測定目的條帶的積分光密度值(integral optical density，IOD)，以目的條帶的IOD值與β-actin條帶IOD值的比值作為該目的蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 各組神經功能評分比較假手術組大鼠無神經缺損癥狀。與假手術組比較，模型組神經功能評分明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，各藥物組神經功能評分明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且冰片+AST Ⅳ+PNS組的效應強于各藥物單用組及AST Ⅳ+PNS組(P<0.05或P<0.01)(見Fig 1)。

3.2 各組腦含水量的比較模型組腦組織含水量明顯高于假手術組(P<0.01)。與模型組比較，各藥物組腦含水量明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且AST Ⅳ+PNS組明顯低于AST Ⅳ單用組及PNS單用組(均P<0.05)，冰片+AST Ⅳ+PNS組明顯低于各藥物單用組及AST Ⅳ+PNS組(P<0.05或P<0.01)(Fig 2)。

Fig 1 Comparison of neurologic function score

A: Sham; B: Model; C: Borneol; D: AST Ⅳ; E: PNS; F: AST Ⅳ+PNS; G: Borneol+AST Ⅳ+PNS; H: Edaravone.△△P<0.01vssham;★P<0.05,★★P<0.01vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vsborneol +AST Ⅳ+PNS

Fig 2 Comparison of brain water content among each group , n=5)

A: Sham; B: Model; C: Borneol; D: AST Ⅳ; E: PNS; F: AST Ⅳ+PNS; G: Borneol+AST Ⅳ+PNS; H: Edaravone.△△P<0.01vssham;★P<0.05,★★P<0.01vsmodel;●P<0.05,vsAST Ⅳ+PNS;#P<0.05,##P<0.01vsborneol +AST Ⅳ+PNS

3.3 各組BBB通透性的變化假手術組高密度的鑭顆粒僅附著在毛細血管內壁表面，呈連續(xù)線性分布，毛細血管內皮細胞間緊密連接、基底膜及毛細血管外均未見鑭顆粒沉積，腦組織形態(tài)結構正常。在模型組，鑭顆粒彌漫分布在基底膜、腦組織細胞間及細胞內，BBB破壞嚴重，通透性增加，腦組織高度水腫，內皮細胞及周圍神經細胞失去正常形態(tài)和結構。在冰片組和AST Ⅳ、PNS單用組，鑭顆粒在腦組織中的分布有所減少，腦組織水腫有所減輕。在AST Ⅳ+PNS組，水腫明顯減輕，BBB緊密連接呈部分開放，鑭顆粒大部分分布在毛細血管內表面，少部分穿過毛細血管壁進入基底膜，神經細胞內未見明顯鑭顆粒浸潤。在冰片+AST Ⅳ+PNS組以及陽性對照依達拉奉組，鑭顆粒在毛細血管內壁呈線性排列，腦組織無明顯水腫，腦實質未見鑭顆粒浸潤，周細胞、各細胞器形態(tài)結構基本正常(Fig 3)。

3.4 各組微血管內皮細胞ZO-1、ZO-2、Occludin及Claudin5蛋白分布表達的比較(免疫組化法)Fig 4～6和Tab 1顯示，ZO-1、ZO-2和Occludin蛋白在假手術組微血管內皮細胞上分布較多；腦缺血/再灌注后，各蛋白的分布及含量均明顯低于假手術組(均P<0.01)。與模型組比較，冰片、PNS及AST Ⅳ+PNS組ZO-1和Occludin蛋白表達明顯增多(P<0.05或P<0.01)，AST Ⅳ組ZO-1表達增加(P<0.05)，且AST Ⅳ+PNS升高ZO-1的效應明顯強于AST Ⅳ、PNS單用(P<0.05或P<0.01)。冰片+AST Ⅳ+PNS及依達拉奉組ZO-1、ZO-2及Occludin蛋白表達明顯增加(P<0.05或P<0.01)，且冰片+AST Ⅳ+PNS增加ZO-1、ZO-2及Occludin蛋白的效應明顯強于各藥物單用及AST Ⅳ+PNS(P<0.05或P<0.01)。

3.5 各組腦組織ZO-1、ZO-2、Occludin及Claudin-5蛋白表達的比較(Western-blot法)Fig 7和Tab 2結果顯示，腦缺血/再灌注后，ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin-5蛋白表達明顯下調(均P<0.01)。與模型組比較，AST Ⅳ組ZO-1蛋白表達增加(P<0.05)，冰片組與PNS組ZO-1、Occludin蛋白表達增加(P<0.05或P<0.01)，AST Ⅳ+PNS組、冰片+AST Ⅳ+PNS組及依達拉奉組ZO-1、ZO-2及Occludin蛋白表達增加(P<0.05或P<0.01)。且AST Ⅳ+PNS組上調ZO-1、Occludin蛋白表達的效應明顯強于AST Ⅳ、PNS單用組(P<0.05或P<0.01)，冰片+AST Ⅳ+PNS組上調ZO-1、ZO-2及Occludin蛋白表達的效應明顯強于各藥物單用組及AST Ⅳ+PNS組(P<0.05或P<0.01)。各藥物對Claudin-5蛋白表達的下調無明顯效應(P>0.05)。

Tab 1 Comparison of expressions of tight junction proteins such as ZO-1, ZO-2, Occludin in microvascular endothelial cells among each group , n=5)

△△P<0.01vssham;★P<0.05,★★P<0.01vsmodel;●P<0.05,●●P<0.01vsAST Ⅳ+PNS;#P<0.05,##P<0.01vsborneol +AST Ⅳ+PNS

Fig 3 Comparison of BBB permeability among each group (×15 000, bar=2 μm)

A：Sham;B:Model;C:Borneol;D:AST Ⅳ；E：PNS；F：AST Ⅳ+PNS；G：Borneol+AST Ⅳ+PNS;H:Edaravone

Fig 4 Immunohistochemistry pattern of ZO-1 protein in each group (×400)

The arrow indicates the positive expression of ZO-1 protein on the vascular wall. A：Sham;B:Model;C:Borneol;D:AST Ⅳ；E：PNS；F：AST Ⅳ+PNS；G：Borneol+AST Ⅳ+PNS;H:Edaravone

Fig 5 Immunohistochemistry pattern of ZO-2 protein in each group(×400)

The arrow indicates the positive expression of ZO-2 protein on the vascular wall. A：Sham;B:Model;C:Borneol;D:AST Ⅳ；E：PNS；F：AST Ⅳ+PNS；G：Borneol+AST Ⅳ+PNS;H:Edaravone

Fig 6 Immunohistochemistry pattern of Occludin protein in each group(×400)

The arrow indicates the positive expression of Occludin protein on the vascular wall. A：Sham;B:Model;C:Borneol;D:AST Ⅳ；E：PNS；F：AST Ⅳ+PNS；G：Borneol+AST Ⅳ+PNS;H:Edaravone

Tab 2 Comparison of expressions of ZO-1, ZO-2, Occludin and Claudin-5 proteins in rat brain tissues of each group , n=5)

△P<0.05,△△P<0.01vssham;★P<0.05,★★P<0.01vsmodel;●P<0.05,●●P<0.01vsAST Ⅳ+PNS;#P<0.05,##P<0.01vsborneol +AST Ⅳ+PNS

Fig 7 Western blot pattern of ZO-1, ZO-2, Occludin proteins in rat brain tissues of each group

4 討論

BBB的屏障特性主要取決于毛細血管內皮細胞和細胞間緊密連接(TJs)結構和功能的完整性[10]。緊密連接蛋白由多種蛋白組成，主要包括胞漿黏附蛋白(ZO)家族、跨膜蛋白和細胞骨架蛋白，跨膜蛋白又包括咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudin)和連接黏附分子[2]。ZO-1是一種細胞質附著蛋白，位于緊密連接內皮細胞的胞質面。作為緊密連接復合體的重要組成單元，ZO-1、Occludin和Claudin 蛋白連同肌動蛋白一起，將跨膜蛋白錨定在形成細胞骨架的內皮細胞上[11]。ZO-1表達水平與BBB開放與關閉狀態(tài)密切相關，其功能和結構的改變可導致TJs解離，繼而引起細胞間隙和血管通透性增加[12]，ZO-1表達下調常提示BBB完整性受損，可作為BBB破壞的標志。ZO-2與ZO-1以復合物的方式定位于TJs的胞質側，共同參與組成調節(jié)基因表達和細胞功能的信號傳導通路[13]。 Occludin和Claudin-5是調節(jié)BBB通透性的兩種重要跨膜蛋白[14]，在腦微血管內皮上高度表達，Claudin-5、Occludin蛋白表達下降可作為BBB損傷的標志[15]。

本研究結果顯示，腦缺血/再灌注后，神經功能評分和腦組織含水量明顯增加。各藥物組能明顯降低神經功能評分和腦含水量，以冰片+AST Ⅳ+PNS組與依達拉奉組的效應最強，且冰片+AST Ⅳ+PNS組的效應強于各藥物單用及AST Ⅳ+PNS組。說明冰片與AST Ⅳ、PNS配伍能更好地緩解腦缺血后神經功能缺損癥狀和腦水腫。

鑭示蹤電鏡結果顯示，在正常腦組織，硝酸鑭顆粒未滲透至毛細血管管腔外，緊密連接和BBB通透性正常。腦缺血/再灌注后，毛細血管內大量鑭顆粒漏出，分布在基底膜、腦組織細胞間隙及細胞內，腦組織水腫明顯，表明缺血導致緊密連接及BBB破壞，血管通透性增加，導致腦水腫和腦組織損傷。各藥物組均能減輕上述病理改變，尤以冰片+AST Ⅳ+PNS組及陽性對照依達拉奉組作用更明顯。說明冰片、AST Ⅳ、PNS能夠降低腦缺血/再灌后BBB破壞和毛細血管通透性，減輕腦水腫和腦組織損傷，且三藥合用后作用增強。同時也說明冰片促進AST Ⅳ及PNS有效成分進入腦組織的作用并非是通過增強BBB通透性、開放BBB來實現的。

ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin-5檢測結果表明，這4種蛋白在正常大鼠毛細血管壁上均有表達，腦缺血/再灌注后，其表達均明顯減少，表明緊密連接蛋白表達降低是引起腦缺血/再灌注后BBB通透性增加的重要原因。各藥物可明顯抑制ZO-1蛋白表達的降低；除AST Ⅳ外，各藥能明顯上調Occludin蛋白表達；冰片+AST Ⅳ+PNS和依達拉奉還能明顯上調ZO-2蛋白表達。且冰片+AST Ⅳ+PNS上調ZO-1、ZO-2、Occludin的效應強于各藥物單用及AST Ⅳ+PNS。說明各藥物對腦缺血后ZO-1、ZO-2、Occludin表達均有促進作用，三種藥物配伍的效應比藥物單用和AST Ⅳ+PNS更加明顯，這對于更好地維持腦缺血后緊密連接的穩(wěn)定性和BBB的通透性具有重要的意義。

綜上所述，腦缺血/再灌注后，大鼠BBB破壞、毛細血管通透性增加，出現腦水腫和腦組織損傷。冰片、AST Ⅳ和PNS能不同程度降低BBB通透性，減輕腦水腫和腦組織損傷，三種藥物合用能起到增效作用。說明冰片與AST Ⅳ、PNS聯(lián)用，其“引藥上行”促進AST Ⅳ及PNS有效成分入腦的作用不但不是通過開放BBB來實現，而且還可降低腦缺血/再灌注后BBB的通透性、減輕腦水腫，增強AST Ⅳ及PNS抗缺血性腦損傷的作用，該作用可能與協(xié)同抑制腦缺血/再灌注后緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2、Occludin蛋白表達的下調有關。