臨床金黃色葡萄球菌對消毒劑耐藥性研究

張艷嬌，劉海鋒，廖小微，李柏舟，孫豐慧，代敏，郭莉娟＊

（1.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)院，四川成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院四川省動物源性獸藥殘留防控工程實驗室，四川成都 610500）

金黃色葡萄球菌是一種常見致病菌，也是導(dǎo)致院內(nèi)感染的最主要的一種病原體，是化膿性感染的重要病原菌，其主要致病毒素為腸毒素、PVL殺白細胞毒素、中毒性休克毒素-1等[1]。金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致創(chuàng)面?zhèn)凇⑵つw軟組織以及血液等感染[2]，極大地危害人體健康。本實驗對從醫(yī)院取樣并分離純化的金黃色葡萄球菌進行對十六烷基三甲基溴化銨、苯扎氯銨、十二烷基二甲基芐基溴化銨、雙十烷基二甲基氯化銨和氯代十六烷基吡啶這5種常用季銨鹽消毒劑的最低消毒劑抑菌濃度（MIC）測定，為醫(yī)院合理使用消毒劑提供有力依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 菌株來源

樣品為從醫(yī)院采集，并經(jīng)分離鑒定的金黃色葡萄球菌共107株，實驗室保存。質(zhì)控菌株為ATCC10536。

1.2 試劑

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA），由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MHA），由OXOID公司生產(chǎn)。

消毒劑：十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethy Ammonium Bromide，CTAB），苯扎氯銨（Benzalkonium chloride，BC）98%，十二烷基二甲基芐基溴化銨（Dodecy Dimethyl Benzyl Ammonium Bromide，DDBAB）氯代十六烷基吡啶（Cetylpyridinium Chloride Monohydrate，CTPC），雙十烷基二甲基氯化銨（Didecyl Dimethyl Ammonium Chloride，DDAC）99%，以上消毒劑均為成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品。

1.3 消毒劑最低抑菌濃度（MIC）測定[3]

1.3.1 菌懸液制備

將金黃色葡萄球菌增菌平板從恒溫培養(yǎng)箱中取出，用無菌棉簽蘸取3～5個單菌落加入3mL無菌生理鹽水中，充分混勻，制備菌懸液，菌懸液濁度相當(dāng)于0.5麥氏比濁。取充分混勻后的菌懸液200μL加入1.8mL生理鹽水中，稀釋完成，并于分光光度計在625nm處檢查吸光度在0.08～0.10，菌液再稀釋10倍。

1.3.2 制備消毒劑平板

采用二倍稀釋法將消毒劑稀釋為10240mg/L、5120mg/L、2560mg/L、1280mg/L、640mg/L、320mg/L、160mg/L、80mg/L、40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L和2.5mg/L。每個平皿加2mL消毒劑以及18mL MHA培養(yǎng)基并將其充分混勻，冷卻凝固即可得到分別含有不同濃度消毒劑的MHA培養(yǎng)基平板（終濃度為0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L依次遞增到1024mg/L），每個濃度做3個平行組。

1.3.3 接種培養(yǎng)

吸取按照上述操作制備的金黃色葡萄球菌菌液1mL，用多點接種儀從毒劑低濃度平皿依次至高濃度進行接種。接種完成后，將平板正向靜置10 min后置于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)18～24h。

1.3.4 結(jié)果觀察與記錄

培養(yǎng)完成后，取出MHA平板并放置于暗色且無反光的桌面上，仔細觀察消毒劑平板上各金黃色葡萄球菌菌斑的生長情況，以剛好完全不見某金黃色葡萄球菌樣品生長的MHA平板所對應(yīng)的消毒劑最低濃度為試驗終點，即該金黃色葡萄球菌樣品的消毒劑最低抑菌濃度。詳細記錄各消毒劑濃度平皿上接種的金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度，以供實驗進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑MIC值測定結(jié)果

107株金黃色葡萄球菌在不同消毒劑濃度下的菌株分布情況見表1。由表1可知，107株金黃色葡萄球菌對BC的MIC值為0.5～256mg/L。其中，對BC的MIC值為1mg/L的菌株有22株（20.56%），MIC值為2mg/L的菌株有16株（14.95%），MIC值為4mg/L的菌株有13株（12.15%），MIC值為8mg/L的菌株有19株（7.48%），MIC值為128mg/L的菌株有21株（19.63%）。

表1 107株金黃色葡萄球菌在不同消毒劑濃度下的菌株分布情況

107株金黃色葡萄球菌對DDBAB的MIC范圍為0.5～256mg/L：MIC值為2mg/L的菌株有24株（22.43%），MIC值為4mg/L的菌株有25株（23.36%），MIC值為64mg/L的菌株有22（20.56%）株，MIC值為256mg/L的菌株有11株（10.28%）。

107株金黃色葡萄球菌對DDAC的MIC值與以上兩種相近，為0.25～256mg/L，其中：MIC值為0.5mg/L的菌株有20株（18.69%），MIC值為2mg/L、4 mg/L的菌株均有16株（14.95%），MIC值為32mg/L的菌株有24株（22.43%）。

107株金黃色葡萄球菌對CTAB的MIC值為2～1024mg/L，其中：MIC值為2mg/L的菌株有12株（11.21%），MIC值為4mg/L的菌株有27株（25.23%），MIC值為8mg/L的菌株有24株（22.43%），MIC值為512mg/L的菌株有12株（11.21%）。

107株金黃色葡萄球菌對CTPC的MIC值為1～1024mg/L，其中：MIC值為2mg/L的菌株有45株（42.06%），MIC值為4mg/L的菌株有23株（21.5%），MIC值為512mg/L的菌株有13株（12.15%）。

2.2 金黃色葡萄球菌對季銨鹽類消毒劑的MIC90和MIC50

107株臨床金黃色葡萄球菌對CTAB、BC的MIC50都為8 mg/L，對DDBAB、CTPC、DDAC的MIC50都為4mg/L；對CTAB的MIC90為512mg/L、BC的MIC90為128mg/L、DDBAB的MIC90為256mg/L、DDAC的MIC90為64mg/L這三種消毒劑的MIC90均為256mg/L，CTPC的MIC90可達1024mg/L。從MIC90來比較，CTPC＞CTAB＞DDBAB＞BC＞DDAC。由此可見，DDAC的消毒劑效果最好。

3 討論

金黃色葡萄球菌在臨床標本中的分離率呈逐年遞增的趨勢[4]，已成為醫(yī)院感染的重要致病菌之一。鹿桂乾等[5]研究認為，季銨鹽消毒劑的取代烷基為十二烷基和十六烷基時對金黃色葡萄球菌的殺滅效果較好，而當(dāng)消毒劑為帶短烷基鏈的季銨鹽消毒劑時，其對金黃色葡萄球菌的殺滅能力較弱。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，部分金黃色葡萄球菌對苯扎溴銨（BC）產(chǎn)生了一定抗性[6]。高文鳳等[7]采用懸液定量殺菌試驗法，測得BC在濃度為200mg/L時即可對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生較好的滅菌效果；而李春梅等[8]則測得BC在濃度為1000mg/L時可對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生較好的滅菌效果。

季銨鹽類消毒劑使用歷史已十分長久，其性能溫和，對人體皮膚黏膜無刺激性[9]，且毒性低、對被消毒物品無損害[10]，但其屬于一類低效消毒劑。近年來，復(fù)合季銨鹽消毒劑發(fā)展較快，但實際功效仍待考慮。張利平等[11]認為，復(fù)合季銨鹽消毒劑對金黃色葡萄球菌具有較強的殺滅作用，而李長青等[12]認為復(fù)合季銨鹽類消毒劑雖性能穩(wěn)定，腐蝕性較低，但仍屬于低效消毒劑，在消毒實踐中應(yīng)該合理地選擇和使用。在醫(yī)院、單位等進行消毒時，應(yīng)注意消毒劑的使用量，按照正確用量使用，切勿濫用消毒劑導(dǎo)致細菌產(chǎn)生抗性或用量過低導(dǎo)致滅菌不完全而導(dǎo)致的耐藥性增強，同時應(yīng)避免消毒劑殘留時間過長導(dǎo)致細菌耐藥性增強。除此之外，應(yīng)定期更換使用的消毒劑種類，避免細菌長期頻繁接觸同種消毒劑導(dǎo)致對消毒劑產(chǎn)生耐藥性。