米曲霉種曲和堿性蛋白酶協同水解玉米-大豆蛋白復配物及其產物的抗氧化活性

馬瑞，劉祥，林巍，王曉杰，鄭喜群，劉曉蘭*

1(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 2(黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶，163319)3(黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是機體內正常代謝產物，如超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基和氧原子等均為人體細胞內ROS[1-4]，在參與細胞信號轉導、維持體內氧化還原狀態的平衡中起著重要作用。當機體受到某些外界刺激時，活性氧的產生和清除失去平衡，使細胞發生氧化應激，進而活性氧攻擊蛋白質、脂質和DNA等生物大分子，導致細胞衰老并誘發一系列疾病，如心血管疾病、糖尿病、癌癥、動脈硬化、類風濕性關節炎和神經退行性疾病[5-7]。具有抗氧化活性的物質可以清除細胞內產生的過量自由基，對氧化應激的細胞起到保護作用[8]。近年來，具有抗氧化活性的天然活性肽受到較多關注，如從玉米[9-13]、雞蛋[14]、大豆[15-17]中通過蛋白酶酶解制備的抗氧化活性肽，這些活性肽較人工合成的抗氧化劑更安全可靠，不僅可以提供人體所需的營養還可調節機體氧化還原平衡狀態。

玉米蛋白粉是濕法生產淀粉的主要蛋白副產物，蛋白質含量約為60%，富含亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸，缺乏色氨酸和賴氨酸等人體必需氨基酸；大豆蛋白的蛋白質含量在90%以上，富含人體必需氨基酸色氨酸和賴氨酸。將玉米蛋白和大豆蛋白按一定比例復配后，復配物的氨基酸組成更加符合人體氨基酸需求。利用蛋白酶水解蛋白提高其功能性存在一個普遍問題：隨著蛋白酶解反應進行，一些疏水性氨基酸基團暴露在肽鏈的一端，蛋白水解物呈現一定苦味。米曲霉種曲在發酵過程中能產生復合蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等，在食品發酵工業中有著廣泛的應用，用含多種蛋白酶的米曲霉種曲水解蛋白質會降低水解物的苦味，在提高總體反應轉化率、使反應產物的生理功能性得到更多釋放與提高的同時，使蛋白水解物的苦味值保持在可接受范圍內。

本研究用米曲霉種曲和堿性蛋白酶(alcalase)協同水解玉米大豆蛋白復配物，分析蛋白水解物的抗氧化活性，將蛋白水解物作用于人結腸癌細胞(Caco-2細胞)，研究其在細胞內的抗氧化活性和氧化應激條件下對細胞內活性氧(ROS)的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉,黑龍江省龍鳳玉米開發有限公司；Caco-2細胞,南京凱基生物技術有限公司；米曲霉種曲,黑龍釀造有限公司；堿性蛋白酶(alcalase),丹麥諾維信公司；DMEM (高糖) 培養基和胰蛋白酶,美國Gibico公司；胎牛血清(FBS),德國PAN公司；噻唑蘭(MTT),上海生工生物技術有限公司；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA),美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO) 和高效RIPA裂解液,北京索萊寶科技有限公司；活性氧(ROS)試劑盒,南京建成生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 主要的儀器與設備

NV4750E二氧化碳培養箱,NUAIRE(美國)公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺,安泰空氣技術(蘇州)有限公司；LX73熒光倒置顯微鏡,Olympus(日本東京)公司；EnSpire多功能酶標儀,珀金埃爾默(美國)公司產品；SX-500高溫蒸汽滅菌鍋,TOMY(日本)公司產品；PC/PLC-LD-53冷凍干燥機,MILLROCK(美國)公司；96孔板、6孔板、細胞培養瓶和移液管,Corning(美國)公司。

1.3 研究方法

1.3.1 米曲霉種曲和alcalase協同水解玉米大豆蛋白復配物

將m(玉米蛋白)∶m(大豆蛋白)=7∶3的比例進行混合，配成質量濃度為100 g/L的蛋白懸液，用米曲霉種曲和alcalase協同水解玉米大豆蛋白復配物。米曲霉種曲的最適水解條件：55 ℃， pH 8.5，水解時間為22 h；alcalase的最適水解條件：60 ℃，pH 8.5，水解時間為2 h。在反應過程中用1 mol/L NaOH維持pH穩定，并記錄NaOH消耗量，計算水解過程中的水解度。反應結束后，將反應體系置于沸水浴中滅酶15 min，冷卻后4 000 r/min離心15 min，測定上清液的Fe2+螯合能力和DPPH自由基清除率，剩余上清液凍干備用。

1.3.2 蛋白水解物的抗氧化活性測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除率的測定

在10 mL離心管中加入2 mL CSPH溶液和2 mL 0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，振蕩搖勻后室溫下避光反應30 min，立即倒入石英比色皿中，在517 nm波長下用紫外可見分光光度計測得吸光值，重復測定3次。按公式(1)計算：

(1)

1.3.2.2 金屬離子(Fe2+)螯合能力的測定

在10 mL離心管中加入1 mL CSPH溶液、2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和2 mL 0.5 mmo/L菲咯嗪溶液，振蕩搖勻后室溫下靜置10 min，立即倒入石英比色皿中，在562 nm波長下用紫外可見分光光度計測得吸光值，重復測定3次。按公式(2)計算：

(2)

1.3.3 細胞培養

Caco-2細胞培養于37 ℃ 5%(體積分數)CO2的培養箱中，用DMEM (高糖)培養基，并向DMEM中添加體積分數10%胎牛血清(FBS)和體積分數1%的雙抗作為Caco-2細胞的生長培養基。待細胞生長融合度達到80%～90%時，進行傳代培養。實驗選用20～30代細胞。

1.3.4 蛋白水解物對細胞存活率的測定

將對數期Caco-2細胞以濃度為1×105cells/mL接種至96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液培養24 h，然后，每孔加入100 μL終濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/mL CSPH4培養液，培養細胞24 h后每孔加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，在37 ℃ 500 r/min微孔板振蕩儀振蕩10 min，在570 nm波長下用酶標儀檢測OD值。計算細胞存活率：

(3)

1.3.5 氧化應激模型構建及實驗分組

將Caco-2細胞以1×105cells/mL接種至96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液。實驗分為對照組(0 mmol/L H2O2)；氧化應激組(1 mmol/L H2O2)；實驗組(0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/mL CSPH4+1 mmol/L H2O2)，細胞存活率測定方法同1.3.4。

1.3.6 蛋白水解物對Caco-2細胞內ROS的清除能力測定

將Caco-2細胞以1×105cells/mL接種至96孔板，加CSPH4培養細胞2 h后，用1 mmol/L H2O2進行氧化應激處理，PBS清洗細胞2次后，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，在CO2培養箱中孵育30 min，細胞用PBS清洗后，在激發波長為485 nm，發射波長為500 nm的條件下用酶標儀測定熒光強度。

(4)

1.3.7 蛋白水解物對細胞內抗氧化能力的測定

CAA(cellular antioxidant activity)測定參考WOLF和LIU的方法[18]，將Caco-2細胞以1×105cells/mL接種于96孔板中，每孔100 μL細胞懸液，細胞培養24 h后去除培養液，PBS清洗細胞1次，實驗組每孔加入不同濃度CSPH4的DMEM培養液，其中含25 μmol/L DCFH-DA的DMEM，作用Caco-2細胞2 h后，用100 μL PBS清洗細胞一遍，每孔加入100 μL 600 μmol/L的AAPH溶液，將96孔板放入酶標儀中，在激發波長485 nm，發射波長530 nm條件下，每5 min檢測一次,連續測定1 h。設定空白組和對照組，空白組僅采用DCFH-DA處理，但不加入AAPH；對照組采用DCFH-DA和AAPH自由基處理，但不加入樣品。實驗中用Trolox作為陽性對照。

(5)

1.3.8 數據處理

實驗中的數據均以平均值±標準偏差表示。用SPSS Statistics 19.0進行統計學分析，數據間的顯著性差異采用單因素方差分析(LSD檢驗)，P<0.05為差異性顯著水平。用GraphPad Prism 5繪制圖表。

2 結果與討論

2.1 玉米大豆蛋白復配物的水解

蛋白質被蛋白酶水解時，不同的蛋白酶均有其特定的酶切位點，隨著反應的進行，蛋白質的酶切位點不斷減少。用alcalase和米曲霉種曲協同水解玉米大豆蛋白復配物，可以很好地增強蛋白質水解效果，將原料充分利用起來，提高利用率。

在玉米大豆蛋白復配物質量濃度為100 g/L的條件下，考察了alcalase和米曲霉種曲在不同加酶順序和不同加酶量的條件下，協同水解玉米大豆蛋白復配物的效果，水解物的DH、可溶性蛋白含量、DPPH·清除率和亞鐵離子螯合能力的結果如表1所示。

表1 酶底比與加酶順序對堿性蛋白酶和米曲霉種曲協同水解玉米大豆蛋白復配物的影響Table 1 Hydroltsis effect of E∶S ratio and proteases adding sequence on corn soybean protein mixture by alcalase and Aspergillus oryzae

從表1可以看出，alcalase和米曲霉種曲的加入順序對水解物DH和可溶性蛋白含量影響較大。在雙酶協同順序水解過程中，從DH和可溶性蛋白含量上來看，先用米曲霉的水解效果比先用alcalase的好。將米曲霉種曲的加酶量固定為10%(質量分數)，改變alcalase的加酶量，結果發現alcalase為0.8%(質量分數)時，無論其為第1種酶或第2種酶，DH和可溶性蛋白含量均大于加酶量為0.5%(質量分數)組；米曲霉+alcalase組合的水解效果要優于alcalase和米曲霉組合，其可能原因是，米曲霉種曲蛋白酶系復雜，且活力不高，先加入米曲霉可以將破壞大分子蛋白質的空間結構破壞，使alcalase的切割位點大量暴露出來，增加了alcalase的水解效率；而先加入alcalase，其自身就可以將大分子蛋白質水解成大量分子量小于1 000 Da的肽段[19]，再加入米曲霉后，反應體系中以小分子肽段為主，米曲霉自主產生的蛋白酶活力不高，導致這些蛋白酶沒有作用位點，水解效果沒有alcalase和米曲霉種曲組合好。雙酶協同水解復配物產物的抗氧化活性與DH和可溶性蛋白含量沒有正比關系，DH和可溶性蛋白含量高的時候，抗氧化活性不一定強。綜合實際生產過程中的原料利用率情況和蛋白酶成本，將CSPH4作為接下來細胞實驗的原料，此條件下DH、可溶性蛋白含量、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力分別為46.10%、(73.04±1.68) mg/mL、(41.26±0.69)%和(50.23±3.15)%。

2.2 CSPH4對Caco-2細胞存活率的影響

不同濃度的CSPH4對Caco-2細胞存活率存在顯著性(P<0.05)差異，與對照組相比，CSPH4在0.05～2.00 mg/mL濃度范圍內，細胞存活率均≥對照組細胞存活率，即CSPH4對Caco-2細胞無毒性。

圖1 玉米大豆蛋白水解物對Caco-2細胞存活率的影響Fig.1 Effect of corn soybean protein hydrolysate on Caco-2 cell viability注：肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05);相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

2.3 CSPH4對氧化應激的Caco-2細胞的保護作用

不同濃度的CSPH4培養Caco-2細胞后用1 mmol/L H2O2進行氧化應激，測得細胞存活率如圖2所示。

圖2 玉米大豆蛋白水解物對H2O2誘導氧化應激Caco-2細胞的保護作用Fig.2 Cytoprotective effects of mixture of corn soybean protein hydrolysate on H2O2 induced oxidized Caco-2 cells

細胞經1 mmol/L H2O2作用后，細胞存活率顯著(P<0.05)降低，表明氧化應激模型構建成功。CSPH4在實驗濃度范圍內，預培養Caco-2細胞后再進行氧化應激，與氧化應激組相比，細胞存活率均顯著(P<0.05)提高，其中CSPH4濃度在0.05 mg/mL時保護細胞效果最好，此時細胞存活率可達到 92.82%，與H2O2氧化損傷組相比，細胞存活率提高了40%左右。WANG等[20]發現2種玉米肽組分濃度在0.05～2.5 mg/mL范圍內可以顯著提高氧化應激條件下HepG2細胞的存活率，對已發生氧化損傷的HepG2細胞有保護作用，濃度為2.5 mg/mL時，相比氧化損傷組細胞存活率來看，經玉米肽預處理2 h后可使細胞存活率提高50%左右。YI等[21]研究了一種來源于雞蛋卵鐵蛋白的ACE抑制肽(Ile-Arg-Trp)對Caco-2細胞的保護作用，結果發現經50 μmol/L IRW預處理細胞0.5 h后，可以保護細胞免受H2O2氧化損傷，此時細胞存活率提高了15.7%。

2.4 CSPH4對細胞內ROS的清除能力

CSPH4可使細胞存活率提高可能與其降低細胞內ROS水平有關。因此，用H2O2構建氧化應激模型，測得細胞內ROS水平如圖3所示。

圖3 氧化應激條件下玉米大豆蛋白水解物對細胞內ROS清除能力的影響Fig.3 Intracellular ROS scavenging capacities of corn soybean protein hydrolysate under conditions of oxidative stress in cells induced by H2O2

從圖3中可看出，與對照組相比，氧化應激組細胞內ROS水平顯著(P<0.05)升高。與氧化應激組相比，經不同濃度(0.05～2.00 mg/mL) CSPH4處理后細胞內ROS水平顯著降低(P<0.05)，與對照組相比，經CSPH4處理后細胞內ROS水平與對照組無顯著(P>0.05)差異。因此，CSPH4能有效降低H2O2誘導的氧化應激細胞內ROS水平。

2.5 CSPH4對細胞內抗氧化活性的影響

采用熒光探針(DCFH-DA) 法測定細胞內抗氧化活性，DCFH-DA可被細胞膜上的酯酶脫乙酰基水解成DCFH，DCFH可進入細胞內，AAPH自由基經激發后可使細胞內DCFH氧化成具有綠色熒光的DCF。若有抗氧化物質存在，其可通過減少過氧化自由基的產生從而降低熒光強度。CSPH4對細胞內熒光強度的影響如圖4所示。

從圖4可以看出，無論是Trolox還是CSPH4都可以抑制DCF熒光的增加，且呈現劑量依賴關系。根據公式算出CAA活性值，以濃度為橫坐標，CAA活性值為縱坐標，繪制劑量效應曲線如圖5所示。根據圖5計算出Trolox和CSPH4的EC50值分別為0.733和8.968 mg/mL，此時，CSPH4的CAA值為(48.08±2.05) μmol TE/100 g。在CAA實驗中，Caco-2可以吸收CSPH4來清除有AAPH產生的過氧自由基，減少DCF的形成，降低細胞內熒光產生。實驗中測得的Trolox的EC50值與文獻中的值接近[20]。CSPH4的CAA活性值要比藍莓、蔓越莓、蘋果和紅葡萄等在HepG2細胞中CAA活性值高，但略低于綠葡萄CAA活性值[18]。存在的這些差異可能是由于這些抗氧化劑的主要成分與本實驗中肽的主要成分不同導致的，而且不同的細胞之間也會有不一樣的CAA活性值[22]。

圖4 Trolox(A)和CSPH4(B)對熒光強度的影響Fig.4 Effect of Trolox(A) and CSPH4(B) on cellular fluorescence intensity

圖5 Trolox(A)和CSPH4(B)的CAA活性值Fig. 5 The CAA value of Trolox(A) and CSPH4(B)

3 結論

本文研究了米曲霉種曲和堿性蛋白酶順序協同水解玉米大豆蛋白復配物的條件、玉米大豆蛋白水解物的抗氧化能力及氧化應激條件下對Caco-2細胞內ROS的清除能力。玉米大豆蛋白水解物具有良好的抗氧化活性，降低氧化應激條件下Caco-2細胞內ROS含量，在食品工業中具有成為良好抗氧化劑的潛力。