人參皂苷Rg1微球的制備及實驗優化

楊 丹 ，黃 娟 ，彭 娟 ，程 映 ，姜 嵐 （通訊作者）

（1玉溪師范學院化學生物與環境學院 云南 玉溪 653100）

（2昆明醫科大學第一附屬醫院超聲科/云南省超聲診斷質量控制中心/云南省超聲影像研究中心云南 昆明 650032）

人參皂苷Rg1來源于人參屬植物的提取物，是四環三萜類衍生物，研究證實，人參皂苷Rg1具有促進海馬神經發生、改善記憶力、抗膽堿、抗氧化等作用[1-4]。但是研究顯示，人參皂苷Rg1無法通過血腦屏障實現良好的腦疾病的治療作用[5]，并且其在體內容易被降解，半衰期短，同時血腦屏障制了其入腦。載藥納米粒能夠實現對藥物的保護、緩釋和靶向輸送。PLGA是一種可降解的功能高分子有機化合物，具良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料和現代化工業領域，國內外有很多學者們研究使用PLGA作為殼載體來包埋親水性藥物制作納米微球本研究使用PLGA作為載體材料攜帶人參皂苷Rg1，以包封率及平均粒徑為指標，采用正交實驗尋求最優制備條件。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，分子量，LA：GA=50:50，Aladdin industrial Corporation）/ 人參皂苷Rg1（上海源葉生物科技有限公司）、聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA，Sigma-Aldrich Corporation）二氯甲烷、乙腈。超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-IID）、高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity）、Hypersil GOLD液相色譜柱（250×4.6mm×5um，Thermoscientific）、Malvern激光粒度分析儀、磁力攪拌器（溫州標諾儀器有限公司，78-1）、低溫冷凍離心機（Allegra? X-15R）、超純水儀（西安優普儀器設備有限公司，UPT-I-5/10/20T）、電子天平（Precisa ES225SMDR）。

1.2 實驗方法

制備及參數優化：采用復乳-溶劑揮發法制備以PLGA為攜人參皂苷Rg1載體的納米粒微球。精密稱取相應質量的PLGA并放入相應體積的二氯甲烷中，振蕩使其充分溶解，制成油相O；稱取一定質量的人參皂苷Rg1并制成相應濃度的水溶液作為內水相W1；配置1%PVA水溶液為外水相W2。混合W1相與O相，并將其置入超聲波細胞粉碎機行第一次超聲乳化（300W，T1），制得初乳（W1/O），后將初乳W1/O快速加入外水相W2中，再次置入超聲波細胞粉碎機進行第二次超聲乳化（300W，T2），即可得到復乳。將得到的復乳于室溫下攪拌4小時，使有機溶劑充分揮發，既得人參皂苷Rg1納米粒混懸液。將上述液體分裝入離心管內，4000r/min離心5min，收集上清，蒸餾水洗滌三次并離心收集全部上清。離心洗滌后的沉淀干燥后收集既得干粉，置4℃冰箱中保存、備用。在前期預實驗單因素分析后篩選出在制備過程中對包封率及粒徑有影響的五種因素，X1（O相PLGA濃度，mg/ml）、X2（W1與O體積比）、X3（W2與W1/O體積比）、X4（第一次超聲乳化時間，T1）、X5（第二次超聲乳化時間，T2）；每個因素選4個水平，按L16（45）正交表安排實驗，水平重復每一相同實驗三次。見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.3 含量測定

使用高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity）及Hypersil GOLD液相色譜柱（250×4.6mm×5um，Thermoscientific）。乙腈為A相，水為B相，按照表二進行梯度洗脫；進樣量20ul；流速1.0ml/min；檢測波長203nm。

表2 含量測定

1.4 標準曲線的制備

分別稱取一定質量人參皂苷Rg1，配制不同濃度Rg1溶液，按照前述1.3下色譜條件得到的結果，以峰面積（A）對質量濃度（ρ）進行線性回歸，得到人參皂苷Rg1標準曲線：A=3.6654ρ-6.889（r=0.9995）。

1.5 包封率的測定

取1.2項下離心收集的所有上清，據1.3下色譜條件，測定游離藥物量（cfree），按以下公式計算包封率（entrapment efficiency，EE%）=（ctotal-cfree/ctotal）×100%。

2 結果

2.1 正交實驗結果及統計學分析

以正交實驗各序號對應實驗條件制備的人參皂苷Rg1-PLGA微球的包封率（%）及平均粒徑為指標，結果如下表3～表6。

表3 人參皂苷Rg1-PLGA微球包封率單因素分析表

表4 人參皂苷Rg1-PLGA微球包封率正交實驗方差分析結果表

表5 人參皂苷Rg1-PLGA微球粒徑單因素分析表

表6 人參皂苷Rg1-PLGA微球粒徑正交實驗方差分析結果表

由上表可知，X1、X2、X3、X4、X5五個因素對包封率和粒徑影響都有統計學意義（P＜0.001）。五個因素對包封率的影響依次為X2＞X1＞X4＞X5＞X3，五個因素的最佳水平分別為：X1選水平3，X2選水平3，X3選水平1，X4選水平1，X5選水平3，對應的最優條件為：PLGA濃度20mg/ml，W1:O為3:10，W2:W1/O為2:1，第一次超聲乳化時間（T1）10s，第二次超聲乳化時間（T2）90s；而對于粒徑的影響次序，五個因素依次為X1＞X5＞X2＞X4＞X3。對于粒徑來說，每個因素最佳的水平分別為：X1選水平3，X2選水平4，X3選水平1，X4選水平3，X5選水平4，即PLGA濃度20mg/ml，W1:O為2:5，W2:W1/O為2:1，第一次超聲乳化時間（T1）10s，第二次超聲乳化時間（T2）120s。

3 討論

人參皂苷Rg1可溶于水[10]，并且PLGA是一種可降解的功能高分子有機化合物，在人體內可降解為無毒的物質乙酸及羥基乙酸，并且具良好的生物相容性、成膜的性能，因此被廣泛應用于制藥、醫用工程材料領域，可用于攜帶水溶性藥物。而復乳-溶劑揮發法可用于制備水溶性藥物納米粒。通過正交實驗得出，對于包封率而言，要獲得最佳包封率，載體濃度不宜過低及過高，當載體濃度過低，不足以完全包封體系中的人參皂苷Rg1，而當載體濃度過高時，由于人參皂苷Rg1濃度不變，則顯得PLGA相對過多，反而包封率降低，故當PLGA濃度在30mg/ml時Rg1包封率達到最佳；而當油相與內水相體積比增大時，在一定范圍內包封率上升，但當上升至一定程度時反而包封率下降，最佳的內水相與油相比值為3:10，這與文獻相符，可能與體系中的水相Rg1不變時，增加成膜的PLGA則包封率上升，但當其過剩時，由于水相中的Rg1相對減少所以包封率下降。隨著第一次超聲乳化時間的延長，包封率反而下降，可能因為第一次乳化時間過長，增加內水相與油相的團聚機會。因此我們在外水相中加入了1%PVA作為乳化劑，其作用是提高液滴的聚結保護作用。當PLGA濃度增加時，平均粒徑減小，但當初乳與外水相體積比增大，平均粒徑也增加。因此本研究以PLGA為外殼材料可制備PLGA-人參皂苷Rg1納米粒，通過正交實驗能獲得其包封率及平均粒徑制備的最優化條件。