一種螯合型Fe2+探針的構筑及性質

李澤冉 朱健萍 于涵洋 陳韻聰＊, 何衛江 郭子建＊,

(1南京大學化學化工學院，配位化學國家重點實驗室，南京 210093)(2南京大學現代工程與應用科學學院，南京 210008)

鐵是人體中含量較為豐富的必需過渡金屬元素[1-2]，在酶促反應[3-4]、電子傳遞[5]及氧氣運輸[6]等多種生理過程中發揮重要的作用。生命體通過復雜而精細的調節機制來維持鐵離子的平衡。過量的鐵離子會導致活性氧物種含量異常，進而造成細胞損傷和器官功能紊亂[7-8]。鐵離子平衡的破壞與一系列重大疾病相關，如肝炎、癌癥以及阿爾茲海默病與帕金森病等神經退行性疾病。在細胞的還原性環境中，鐵離子大多以Fe2+的形式存在[9-11]。利用熒光探針檢測Fe2+在生命體系中的實時分布信息對于理解鐵離子相關的生物學過程具有重要的意義。

目前報道較多的Fe2+探針主要分為反應型和螯合型。反應型Fe2+熒光探針發展比較成熟，大致可分為兩類。一類是Fe2+與羅丹明上的氮氧自由基反應[12-13]，反應后的羅丹明會發出熒光，達到檢測Fe2+的目的。另一類是利用Fe2+的催化水解作用，使得探針分子中的酰胺鍵水解[14-15]，恢復熒光信號。螯合型的Fe2+熒光探針[16]是利用N，O等原子與Fe2+的配位作用，使得探針分子的構象[17]或發光性能[18]發生變化，從而反映Fe2+的水平。我們選擇穩定性好、量子產率高的BODIPY[19-21]為熒光基團，對Fe2+有較高結合能力的三聯吡啶為螯合團，通過苯乙烯基將熒光團與螯合團連接起來，構建了新型Fe2+螯合型探針BTPY，利用紫外吸收和熒光強度的變化實現了Fe2+特異性識別，并能有效區分Fe3+。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

所有藥品及試劑購自安耐吉、希恩斯或北京伊諾凱試劑公司，使用前均未經過進一步的處理。光譜性質測試中，所用溶劑為光譜純試劑，購自Aldrich公司，水為MILLIPORE處理過的超純水。熒光光譜用FluoroMax-4光譜儀測試，紫外可見吸收光譜在Perkin-Elmer lambda 35光譜儀上測定。熒光光譜和紫外可見吸收光譜數據用Origin軟件處理。探針BTPY的1H NMR和13C NMR譜在Bruker AVANCEⅢ400和Bruker DPX 300核磁儀上用標準脈沖序列測定，用TMS作內標。電噴霧質譜用LCQ電噴霧質譜儀(ESMS，Finnigan)測定，并用 ISOPRO 3.0 程序模擬其同位素分布。

1.2 化合物BTPY及中間體的合成和表征

1.2.1 化合物1的合成

將 4-甲基苯甲醛(9.00 mL，76.38 mmol)，2-乙酰基吡啶(9.00 mL，72.39 mmol)加入2%的NaOH水溶液(150 mL)中，室溫下攪拌6 h。將2-乙酰基吡啶(9.00 mL，72.39 mmol)加入反應體系，調節NaOH水溶液的濃度為20%。60℃下加熱攪拌6 h，冷卻至室溫并過濾，得到黃色濾渣。將濾渣用無水乙醇重結晶，得到淺白色針狀晶型化合物1[22]，產率：20%。1H NMR(300 MHz，CDCl3)：δ2.43(s，3H)，7.32(d，2H，J=8.5 Hz)，7.36(ddd，2H，J=7.7，4.8，1.2 Hz)，7.83(d，2H，J=8.2 Hz)，7.89(td，2H，J=7.7，1.8 Hz)，8.68(dt，2H，J=8.0，1.1 Hz)，8.72～8.76(m，4H)。

1.2.2 化合物2的合成

將化合物1(1.0 g，3.1 mmol)加入四氯化碳溶液(20 mL)中，攪拌15 min。向反應體系中加入過氧化二苯甲酰 (0.05 g，0.2 mmol)和N-溴代琥珀酰亞胺(1.23 g，6.2 mmol)，加熱回流24 h。將溶液冷卻至室溫并旋蒸除去溶劑。將得到的黃色固體加入碳酸鈣(1.0 g，10 mmol)，1，4-二氧六環(40 mL)和水(10 mL)的混合溶液中，回流24 h。冷卻至室溫，旋蒸，硅膠柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚，1∶1，V/V)得到白色固態的化合物2[23]，產率為23%。1H NMR(300 MHz，CDCl3)：δ7.39(ddd，2H，J=7.5，4.8，1.1 Hz)，7.92(td，2H，J=7.8，1.7 Hz)，8.01～8.11(m，4H)，8.70(dt，2H，J=8.0，1.1 Hz)，8.75(ddd，2H，J=4.8，1.9，0.9 Hz)，8.80(s，2H)，10.12(s，1H)。

1.2.3 化合物3的合成

N2保護下， 將 4-甲氧基苯甲醛 (1.36 g，10 mmol)，2，4-二甲基吡咯(2.09 g，22 mmol)加入二氯甲烷(400 mL)中，再加入1滴三氟乙酸，在室溫下攪拌。 12 h 后加入 2，3-二氯-5，6-二氰對苯醌(2.72 g，12 mmol)，室溫攪拌。12 h后加入三乙胺(15 mL)，2 min后再加入三氟化硼乙醚(18 mL)。反應體系室溫攪拌5 h后，旋蒸，用乙酸乙酯萃取。取有機相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥。旋蒸除去溶劑，硅膠柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚，1∶15，V/V)得到紅色晶狀的化合物3[24],產率為38%。1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ1.43(s，6H)，2.55(s，6H)，3.87(s，3H)，5.97(s，2H)，7.01(d，2H，J=8.8 Hz)，7.17(d，2H，J=8.8 Hz)。

1.2.4 化合物BTPY的合成

圖1 探針BTPY及其中間體的合成路線Fig.1 Synthesis of probe BTPY and its intermediates

在微波反應器中，加入化合物2(53.5 mg，0.15 mmol)，化合物 3(50.67 mg，0.15 mmol)，冰醋酸(0.35 mL)，哌啶(0.325 mL，3.28 mmol)和分子篩，以二甲基甲酰胺(10 mL)為反應溶劑。微波反應10 min，旋蒸除去溶劑，硅膠柱層析分離(甲醇/二氯甲烷，1∶20，V/V)得到紫色固態的目標化合物(E)-3-(4-((2，2′∶6′，2″-terpyridin)-4′-yl)styryl)-5，5-difluoro-10-(4-methoxyphenyl)-1，7，9-trimethyl-5H-5λ4，6λ4-dipyrrolo[1，2-c∶2′，1′-f][1，3，2]diazaborinine,命名為 BTPY,產率為 16%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ1.47(s，3H)，1.51(s，3H)，2.63(s，3H)，3.89(s，3H)，6.03(s，1H)，6.65(s，1H，CH)，7.03(d，J=8.2 Hz，2H)，7.22(d，J=8.4 Hz，2H)，7.29(d，J=10.6 Hz,1H),7.39(dd,J=7.6，5.6 Hz,2H),7.73(d，J=5.5 Hz，2H)，7.77(d，J=11.3 Hz，1H)，7.88～7.99(m,4H),8.70(d,J=8.0 Hz,2H),8.74～8.80(m，4H)。13CNMR(100 MHz,CDCl3)：δ14.67，14.81，55.33，114.54，117.57，118.76，119.95，121.53，123.93，127.04，127.64,127.99,129.39,132.57，133.28，134.89，137.17，137.42,138.38,140.76,142.27，143.39，148.94，149.61，151.96,155.74,155.96,160.17。 ESI-MS(positive mode，m/z)：Calcd.674.29，Found：674.42 for[M+H]+。

1.3 探針BTPY光譜性質測試

BTPY用光譜純DMF(N，N-二甲基甲酰胺)配制成1.0 mmol·L-1的儲備溶液放置在4℃冰箱中備用。光譜測試在PBS緩沖溶液體系(10 mmol·L-1，pH=7.40)或光譜純DMF中進行。向3 mL BTPY(10 μmol·L-1)的 PBS緩沖溶液和DMF溶液中，分別加入不同體積的FeCl2水溶液(1 mmol·L-1)，每次加入30μL，充分混合均勻后分別進行熒光光譜滴定和紫外可見吸收光譜滴定測試。

國內對高校實驗室安全管理方面的研究較晚，通過學習國外的相關研究以及結合國內高校實驗室的具體情況，部分研究者曾試圖通過建立安全管理體系，來減少實驗室事故的發生.如葉秉良等通過結合浙江理工大學實驗室安全管理的具體情況，從實驗室布置、安全檢查、技術防范、應急預案等幾個方面構建我國高校實驗室安全管理體系的基本思路[4].李家祥通過研究分析實驗室安全管理中存在的問題及原因，構建了安全建防、安全采購、安全教育等管理舉措，從而來提高實驗室的安全[5].此外，還有部分學者嘗試利用層次分析法、模糊評價、BP神經網絡等方法對實驗室安全管理進行了科學有效評價.

1.4 探針BTPY金屬離子選擇性測試

向 3 mL BTPY(10 μmol·L-1)的溶液中加入相應濃度的金屬離子溶液，充分混合均勻后進行測試。其中， 加入的 K+，Ca2+，Na+，Mg2+離子濃度為 1 mmol·L-1，其余金屬離子濃度為 100 μmol·L-1。

1.5 結合常數測試

向 3 mL BTPY(10 μmol·L-1)的 DMF 溶液中，分別加入不同體積的 FeCl2水溶液 (1 mmol·L-1)或Fe(NO3)3·9H2O 水溶液(1 mmol·L-1)，每次加 30 μL，充分混勻后進行測試。結合常數根據如下公式擬合:

其中F0為探針BTPY在不加Fe2+時，628 nm處的熒光強度。F為加入不同濃度的Fe2+時628 nm處的熒光強度。探針BTPY與Fe2+的結合常數Ka是通過1/(F-F0)對1/cFe2+作圖得到的。1/(F-F0)與1/cFe2+呈線性關系，參照公式，由截距與斜率的比值得到Ka的值。

1.6 結合比測試

在3 mL探針BTPY的DMF溶液中，保持BTPY 與 Fe2+的總濃度為 30 μmol·L-1，調整 BTPY 與Fe2+的不同比例，測試紫外吸收強度。以607 nm處的吸光度對cFe2+/(cFe2++cBTPY)作圖，通過數據點擬合2條直線，通過2條直線的交點得到探針BTPY與Fe2+的結合比。

2 結果與討論

2.1 探針BTPY的光譜性質

如圖 2a 所示，BTPY(10 μmol·L-1)在 10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液(pH=7.40)中有543和584 nm兩個最大吸收峰。其原因是BODIPY與TPY之間的苯乙烯基使得整個分子形成大的共軛體系，使得吸收波長較長。如圖2b熒光光譜所示，BTPY最大激發波長為582 nm，最大發射波長為678 nm，斯托克斯位移是96 nm。激發波長在可見光區，熒光發射波長則進入近紅外區。

圖2 BTPY在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液中的紫外-可見吸收光譜(a),熒光激發和發射光譜(b);BTPY在DMF中的紫外-可見吸收光譜(c),熒光激發和發射光譜(d)Fig.2 UV-Vis absorption spectrum(a),excitation and emission spectra(b)of BTPY obtained in PBSbuffer containing 10%(V/V)DMF;UV-Vis absorption spectrum(c),excitation and emission spectra(d)of BTPY obtained in DMF

而圖2c和d顯示，BTPY在純DMF中的紫外-可見吸收光譜與其在PBS緩沖溶液中明顯不同，最大吸收波長為573 nm，同時532 nm處有一個相對較弱的吸收峰。熒光光譜也發生了變化，最大激發和發射波長分別為573和628 nm，較10%(V/V)DMF中的發射波長藍移了50 nm，依然在近紅外區。這表明不同的溶劑對BTPY的發射波長有很大影響。

2.2 探針BTPY與Fe2+作用的光譜研究

而探針BTPY在DMF中加入 100μmol·L-1的Fe2+，熒光幾乎完全猝滅(圖3b)。這應當與探針BTPY在DMF溶液中的溶解度相關，在純DMF溶劑中，BTPY的溶解度更大，使得與Fe2+的結合能力增強，熒光能夠被完全猝滅。

圖3 Fe2+對BTPY的熒光滴定曲線:(a)在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液;(b)在DMF中Fig.3 Emission spectra of BTPY upon Fe2+titration:(a)in PBSbuffer containing 10%(V/V)DMF;(b)in DMF

當10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液 (pH=7.40)體系中分別加入過量的Fe2+和 Fe3+(100μmol·L-1)，紫外吸收峰的波長并沒有發生明顯的變化(圖4)，僅僅強度稍有下降，可能的原因是在該緩沖溶液體系中，Fe2+和Fe3+與探針結合能力較弱，因此引起的紫外光譜變化很小。

BTPY的 Fe2+和Fe3+的紫外滴定在DMF中完成。如圖5，當逐漸增大金屬離子濃度，BTPY在573 nm處的吸收峰隨金屬離子濃度增大而降低，同時在607 nm處出現一個新的吸收峰，并且隨著Fe2+或Fe3+的加入而逐漸增強。這與文獻報道過的Fe2+會使螯合基團的吸收峰紅移，即出現MLCT吸收峰吻合。實驗也表明，除了Fe2+之外，Fe3+的加入也會使光譜中出現MLCT吸收帶。

圖4 在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液中,BTPY對Fe2+和Fe3+的紫外響應情況Fig.4 UV-Vis spectra of BTPY obtained in PBSbuffer containing 10%(V/V)DMF upon addition of Fe2+and Fe3+

圖5 在DMF中Fe2+(a)和Fe3+(b)對BTPY的紫外滴定曲線和顏色變化Fig.5 UV-Vis absorption spectra and color change of BTPY obtained in DMF upon Fe2+(a)and Fe3+(b)titration

圖6 在DMF中BTPY對常見金屬離子的紫外光譜響應Fig.6 UV-Vis absorption response of BTPY to common metal cations in DMF

探針BTPY對其它常見金屬離子的紫外響應如圖6所示。其它金屬離子的加入，吸收峰不發生明顯紅移，同時溶液顏色也不發生變化。而Fe2+和Fe3+的加入使吸收光譜在607 nm處出現MLCT吸收帶，溶液顏色由亮紅色變為藍紫色。探針BTPY對鐵離子獨特的紫外選擇性，且溶液顏色發生明顯變化，使得BTPY可用于鐵離子的可視化識別。

2.3 探針BTPY與Fe2+結合比及結合常數的測定

在DMF中測定BTPY與Fe2+的紫外吸收Job曲線。固定 BTPY 與 Fe2+的總濃度為 30 μmol·L-1，改變BTPY與Fe2+的比例，得到不同比值下的紫外可見吸收光譜圖。圖7為根據607 nm處的紫外吸收強度得到的Job曲線。吸收強度最大時對應的Fe2+與總濃度的比值為0.56，這表明BTPY與Fe2+以1∶1的方式進行結合。

圖7 在DMF中根據607 nm處的紫外吸光度測定的BTPY與Fe2+結合的Job曲線Fig.7 Job′s plot of BTPY upon addition of Fe2+in DMF determined by UV absorbance at 607 nm

圖8 BTPY與Fe2+在DMF中的Benesi-Hildebrand圖Fig.8 Benesi-Hildebrand plot of BTPY upon addition of Fe2+in DMF

根據熒光滴定光譜，取628 nm處的熒光強度繪制了探針與Fe2+結合的Benesi-Hildebrand圖(圖8)。利用結合常數公式對其進行線性擬合，得到擬合直線的截距和斜率，由此計算得到Ka值為2.28×104L·mol-1。用同樣的方法測得探針與Fe3+的結合常數為 1.82×104L·mol-1(圖 9)。探針 BTPY 與 2種鐵離子的結合常數相差不大。

圖9 BTPY與Fe3+在DMF中的Benesi-Hildebrand圖Fig.9 Benesi-Hildebrand plot of BTPY upon addition of Fe3+in DMF

2.4 探針BTPY對金屬離子的選擇性

如圖10a所示，在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液(pH=7.40)中，Fe2+和Cu2+對熒光有較強的猝滅作用，而其它金屬離子對BTPY基本無響應行為。這說明BTPY對Fe2+和Cu2+有較強的結合能力。在純DMF中(圖 10b)，探針 BTPY 除了對 Fe2+和 Cu2+有猝滅型響應行為以外，也對Ni2+有同樣的熒光降低響應。這說明在DMF溶劑比例增大的情況下，BTPY與Ni2+也能夠較強的結合。

圖10 在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液(a)和DMF(b)中,BTPY在不同金屬離子存在時熒光強度的變化Fig.10 Fluorescence intensity changes of BTPY in the presence of different metal ions in PBSbuffer solution containing 10%(V/V)DMF(a)and DMF(b)

3 結 論

選擇量子產率較高的BODIPY作為熒光基團，對Fe2+有較好結合能力的TPY作為螯合基團，通過苯乙烯基將這2個基團連接起來，增大了分子內的共軛體系，使得探針BTPY的熒光發射進入近紅外區。值得注意的是，在純DMF中，BTPY對Fe2+和Fe3+有特異性的紫外響應，隨著這2種金屬離子的加入，其573 nm處的吸收峰紅移到607 nm處，為典型的MLCT吸收帶。同時，Fe2+和Fe3+的加入，會使溶液顏色由亮紅色變為藍紫色，而探針BTPY對其它離子則沒有這種響應行為，因此，BTPY可用于鐵離子的可視化識別。在10%(V/V)DMF的PBS緩沖溶液中，BTPY選擇性地對Fe2+和Cu2+有熒光猝滅型響應，而對包括Fe3+在內的其它金屬離子基本無響應行為。因此，只有Fe2+能同時引起BTPY紫外光譜的紅移和熒光光譜的猝滅效應，可以實現對Fe2+的高度選擇性檢測。