4-(2-羥基-3-氯)苯基-2，2′∶6′，2″-三聯吡啶Cu（Ⅱ）配合物的合成、結構表征及抗腫瘤活性

鐘玉君 陳振鋒 梁 宏

(廣西師范大學化學與藥學學院，省部共建藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室，桂林 541004)

化療是治療癌癥的重要手段之一，在Rosenberg等發現順鉑的抗腫瘤活性后，人們合成了許多順鉑類似物并應用于臨床。至今，鉑類藥物仍是應用最廣泛的化療藥物[1-2]。但由于鉑類藥物的耐藥性和嚴重的副作用，如急性腎毒性、骨髓抑制和慢性神經毒性[3-4]，促使人們尋找新的非鉑類抗腫瘤金屬配合物[5]。

銅在人體內的含量僅次于鐵和鋅，并且參與生物體中幾個關鍵的生命過程[6]。一般來說，銅的毒性比其他金屬小，因此，銅（Ⅱ）配合物被認為具有克服毒副作用和耐藥性的特性。許多銅（Ⅱ）配合物被報道具有較強的結合與裂解DNA的能力，其中一些具有抗癌和調控凋亡的能力[7-9]。三聯吡啶及其衍生物可以作為DNA結合劑、拓撲酶抑制劑和抗腫瘤藥物，具有潛在的應用價值[10-11]。此外，三聯吡啶作為一種三齒配體，有3個共平面的氮原子，具有與金屬形成穩定金屬配合物的能力，是構建金屬配合物的重要配體[12,14-15]。

為此，我們合成了1個新的三聯吡啶銅（Ⅱ）配合物[Cu2(μ-L-κO，O)2Cl2](1)，通過單晶 X 射線衍射確定了配合物1的晶體結構，測定了配合物1對5種腫瘤細胞株(MGC80-3、T24、A549、HeLa、Hep-G2)的體外抗腫瘤活性，應用流式細胞術測定了配合物1對MGC80-3細胞的凋亡效應及周期阻滯情況。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

所用儀器有：Bruker APEX-Ⅱ CCD單晶衍射儀，德國Bruker AvanceⅢHD 400 MHz核磁共振譜儀，德國Bruker HCT離子阱質譜儀，美國Spectrum Two傅里葉變換紅外光譜儀，德國Vario ELⅢ元素分析儀，美國CARY ECLIPSE紫外可見分光光度計，美國Thermo二氧化碳培養箱，美國TECANM1000酶標定量測定儀，美國BD公司FACSVerse流式細胞儀。

3-氯水楊醛、2-乙酰吡啶及氯化銅均為分析純試劑，購于阿拉丁。胎牛血清及DMEM培養基購自CIBCO公司，MTT購自Solarbio公司。

1.2 配體及配合物的合成與結構表征

配體 4-(2-羥基-3-氯)苯基-2，2′∶6′，2″-三聯吡啶(HL)的合成參考文獻已報道的方法[13]，產率為81.7%。用3-氯水楊醛和2-乙酰吡啶反應合成配體(HL)(Scheme 1)。其結構表征數據為：ESI-MSm/z：397.5[L+K+]。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ15.57(s，1H)，9.08(d，J=1.3 Hz，1H)，8.89(d，J=1.3 Hz，1H),8.84(d，J=4.8 Hz,2H),8.48(d，J=8.0 Hz,1H),8.32(s,1H)，8.23(d，J=7.9 Hz，1H)，8.13(s，1H)，8.06(d，J=17.3 Hz，1H)，7.57(s，2H)，7.56(d，J=9.2 Hz，1H)，7.00(s，1H)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ155.54，155.42，150.65，150.50，149.79，148.10，137.90，130.83,129.48,129.10,124.89，122.65，121.59，121.30。 IR(KBr，cm-1)：3 910(w)，3 889(w)，3 808(w)，3 786(w)，3 697(w)，3 659(w)，3 636(w)，3 574(w)，3 055(m)，3 010(m)，1 693(w)，1 585(s)，1 566(s)，1 547(s)，1 468(s)，1 436(s)，1 391(s)，1 263(m)，1 228(m)，1 177(m)，1 140(m)，1 080(m)，1 042(m)，991(w)，890(m)，867(m)，829(w)，775(s)，737(s)，665(m)，637(m)，621(m)，564(w)，510(w)。

Scheme 1 Synthesis of ligand HL

配合物[Cu2(μ-L-κO，O)2Cl2](1)的合成方法如下：稱取10 mg(0.028 mmol)配體和10 mg(0.056 mmol)CuCl2·2H2O于一端閉合的25 cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加0.25 mL丙酮與1 mL甲醇，液氮冷凍后，在真空條件下將玻璃管開口端熔封，待玻璃管內溶液恢復室溫后置于65℃的烘箱反應72 h。反應結束后梯度降溫至室溫，管內生成墨綠色塊狀晶體(配合物1)，產率為62.7%。挑選出大小、形狀適合的單晶，進行結構表征。配合物1的晶體學及結構修正數據見表1。其結構表征數據如下：ESI-MS m/z：498.6[M-Cu-L-Cl+K+H]+。 元素分析按 C42H26Cl4Cu2N6O2計算值(%)：C 55.10，H 2.86，N 9.18；實測值(%)：C 54.87，H 2.89，N 9.15。IR(KBr，cm-1)：3 909(w)，3 890(w)，3 858(w)，3 843(w)，3 826(w)，3 807(w)，3 787(w)，3 738(w)，3 715(w)，3 695(m)，3 680(w)，3 659(w)，3 635(w)，3 572(m)，3 433(m)，3 057(m)，2 344(w)，1 604(s)，1 569(m)，1 554(m)，1 475(s)，1 450(m)，1 414(s)，1 325(m)，1 301(m)，1 246(s)，1 164(m)，1 138(m)，1 093(m)，1 067(m)，1 052(w)，1 036(m)，1 019(s)，890(m)，870(m)，783(s)，749(m)，736(m)，715(m)，680(m)，656(m)，645(m)，510(w)，414(w)。

1.3 配合物1晶體結構測定

挑選出大小、形狀適合的單晶置于Bruker APEX-ⅡCCD單晶衍射儀上，采用經石墨單色器單色化的 Mo Kα 射線(λ=0.071 073 nm)，在 296.15 K下,2.417°～29.601°(θ)范圍內對配合物 1 的單晶 X 射線衍射數據進行收集。晶體結構使用具有各向異性熱參數的SHELXL-2015[16]的直接方法解出并通過全矩陣最小二乘法 (the full-matrix least-squares method on F2)進行精修。碳原子上的氫原子為理論加氫。配合物1的部分晶體學及結構修正數據見表1。

CCDC：1959094。

表1 配合物1的晶體學及結構修正數據Table 1 Crystal data and structure refinement for complex 1

1.4 體外抗腫瘤活性實驗

采用MTT比色法測定CuCl2·2H2O、配體HL、配合物1及順鉑對所選5種癌細胞株(MGC80-3、T24、A549、HeLa、Hep-G2)的 IC50值。 使用流式細胞術檢測配合物1誘導MGC80-3細胞凋亡以及周期阻滯的情況。

2 結果與討論

2.1 配合物1的晶體結構

配合物1的晶體結構如圖1所示，部分鍵長和鍵角數據詳見表2。配合物1屬于三斜晶系，P1空間群。配合物1為雙核結構，在對稱單元中，中心銅（Ⅱ）離子為五配位扭曲四方錐幾何構型，每個銅離子與1個Cl-以及來自配體L-的2個N原子和2個羥基O原子配位；2個銅（Ⅱ）離子通過羥基的橋聯形成雙核結構。

2.2 配合物1在溶液中的穩定性

用紫外光譜檢測配體HL和配合物1的穩定性(圖 2、3)。 濃度為 20 μmol·L-1的配合物在 pH=7.35的Tris-HCl緩沖液中，置于室溫下0和48 h后，分別用紫外光譜儀各測1次吸光度[17-18]。從圖中可以看出各組吸收峰沒有發生紅移或藍移現象，也沒有新的吸收峰出現，說明配合物1在Tris-HCl緩沖液中能夠穩定存在至少48 h。

圖1 配合物1的橢球率50%的晶體結構圖Fig.1 Crystal structure of complex 1 with 50%probability ellipsoids

表2 配合物1部分鍵長(nm)和鍵角(°)Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)for complex 1

圖2 配體HL的紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of ligand HL

圖3 配合物1的紫外光譜圖Fig.3 UV spectra of complex 1

2.3 體外抗腫瘤活性

為了研究配合物1的體外抗腫瘤活性，我們以人正常肝細胞HL-7702為對照，采用MTT法測定了 CuCl2·2H2O、 配體 HL、配合物 1和順鉑對MGC80-3，T24，A549，HeLa 和 Hep-G2 五種腫瘤細胞株的細胞毒性[19-22]。由表3可知，配合物1對所選的腫瘤細胞株的抑制率均高于CuCl2·2H2O、配體HL及順鉑。其中對人胃癌MGC80-3細胞的抑制率最高，達到了(84.30±1.28)%。如表4所示，從IC50也可以看出，配合物1對人胃癌MGC80-3細胞的細胞毒性最高，其 IC50值為(3.36±0.43)μmol·L-1。 與正常細胞HL-7702相比，配合物1對5種腫瘤細胞均表現出較高的細胞毒性，說明配合物1在一定程度上可以選擇性抑制腫瘤細胞。

表3 化合物對不同細胞株的抑制率Table 3 Inhibition rates of ligand HL,CuCl2·2H2O,complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines%

表4 化合物對不同細胞株的IC50值Table 4 IC50 values of ligand HL,CuCl2·2H2O,complex 1 and cisplatin on the six selected human cell lines μmol·L-1

2.4 細胞凋亡

采用Annexin V FITC和PI雙染色法測定配合物1對MGC80-3細胞的凋亡效應。圖4為藥物濃度分別為 1.5、3.0 和 4.5 μmol·L-1，作用 24 h 后，配合物1誘導人胃癌MGC80-3細胞凋亡的百分數。在給藥濃度4.5μmol·L-1下，細胞凋亡百分數為41.4%，比對照組增加了33.45%，可推測配合物1誘導MGC80-3細胞進入早期凋亡[23]。

圖4 配合物1誘導MGC80-3凋亡的情況Fig.4 Apoptosis in MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

2.5 周期阻滯

圖5 配合物1對MGC80-3細胞周期的影響Fig.5 Cell cycle distribution of MGC80-3 cells exposure to complex 1 for 24 h

采用流式細胞術研究了配合物1誘導MGC80-3細胞的細胞周期阻滯情況[24-25]。圖5為不同濃度下，配合物1作用MGC80-3細胞24 h后的細胞周期阻滯情況。與空白對照組相比，隨著給藥濃度從1.5、3.0、4.5 μmol·L-1逐漸增大，MGC80-3 細胞在G1期的百分比明顯增加，由43.81%分別增至72.14%、72.68%和74.19%，呈濃度依賴關系。說明配合物1使MGC80-3細胞阻滯于G1期，從而抑制腫瘤細胞的生長。

3 結 論

以 4-(2-羥基-3-氯) 苯基-2，2′∶6′，2″-三聯吡啶(HL)作為配體合成了配合物[Cu2(μ-L-κO，O)2Cl2](1)，并用多種分析方法對其進行完整的表征。采用MTT法、流式細胞術對5種腫瘤細胞株及人正常肝細胞HL-7702進行抑制生長活性、細胞凋亡和細胞周期阻滯測試。與配體和順鉑相比，配合物1對不同的細胞株具有更高的細胞毒性，其中對人胃癌MGC80-3細胞的細胞毒性最高，IC50值為(3.36±0.43)μmol·L-1。 配合物 1可以誘導 MGC80-3細胞凋亡，且配合物1使MGC80-3細胞阻滯于G1期。