土壤中20種磺酰脲類除草劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法

趙 彬，張付海，張 敏，王 昭，丁 磊

1.安徽省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，安徽 合肥 230071 2.合肥海關(guān)技術(shù)中心，安徽 合肥 230032

磺酰脲類除草劑是目前使用最廣泛的一類除草劑，為弱酸性物質(zhì)，在土壤中的淋溶和降解速度受土壤pH影響較大[1-3]。其淋溶性隨著土壤pH的增加而增加；在酸性土壤中，降解速度快，在堿性土壤中降解速度慢。該類除草劑大約包含20多種化合物，由于具有高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。但在其使用過程中已遇到一些突出問題：該類除草劑不易揮發(fā)、不易光解，在農(nóng)作物中長(zhǎng)期殘留；隨著雨水的沖刷，在土壤、沉積物和水體中也存在一定殘留，且隨土壤pH上升，半衰期延長(zhǎng)，造成對(duì)自然環(huán)境污染。近些年來磺酰脲類除草劑在農(nóng)作物中的殘留、對(duì)環(huán)境的污染及對(duì)人類健康造成的危害越來越被人類所重視。隨著我國(guó)新的保護(hù)土壤環(huán)境質(zhì)量、管控土壤環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的《國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[4-5]的頒布與實(shí)施，建立起這類除草劑的快速、準(zhǔn)確、有效的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警監(jiān)測(cè)方法就顯得尤為重要。

目前針對(duì)該類除草劑的殘留檢測(cè)方法主要有化學(xué)分析法、酶聯(lián)免疫法、生物測(cè)定法、毛細(xì)管電泳法以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[6-17]。化學(xué)法和酶聯(lián)免疫法雖然操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，但遇到假陽性樣品則不能準(zhǔn)確判斷，需要質(zhì)譜進(jìn)一步確認(rèn)。

生物法、毛細(xì)管電泳法以及單一色譜法，針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的環(huán)境樣品，不能很好確證，受基質(zhì)雜質(zhì)干擾較大。而HPLC-MS/MS技術(shù)因具有高選擇性、高靈敏度及快速準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用，是環(huán)境樣品等復(fù)雜基質(zhì)樣品檢測(cè)、定性定量的優(yōu)選方法。針對(duì)土壤樣品的前處理方法目前有超聲振蕩提取、QuEChERS法凈化、固相萃取小柱法(SPE)凈化等[6-11]，而關(guān)于加速溶劑萃取法(ASE)提取、凝膠滲透色譜法(GPC)尚未見到有關(guān)研究。由于環(huán)境土壤樣品基質(zhì)復(fù)雜，有腐殖酸、色素、動(dòng)物脂肪、微生物、蛋白質(zhì)等強(qiáng)干擾物質(zhì)存在，QuEChERS法和固相萃取小柱法的凈化效果較差，導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，并且無法同時(shí)滿足多種磺酰脲類除草劑的殘留檢測(cè)，不能取得較為理想的回收率。而針對(duì)上述土壤基質(zhì)，凝膠滲透色譜法則能很好解決。而加速溶劑萃取法的提取效率明顯要高于普通的超聲振蕩提取法，并且其具有儀器操作化程度高、樣品重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。

綜上所述，本文在參考相關(guān)國(guó)家殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和磺酰脲類除草劑使用現(xiàn)狀情況下，選擇了煙嘧磺隆、甲酰胺磺隆、環(huán)氧嘧磺隆、甲基噻吩磺隆、甲磺隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆、四唑嘧磺隆、甲磺胺磺隆、三氟啶磺隆、丙苯磺隆、氟磺隆、吡啶磺隆、氯嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、氟胺磺隆、甲基氟嘧磺隆、環(huán)丙嘧磺隆等20種磺酰脲類除草劑作為研究對(duì)象，建立了農(nóng)用地土壤中20種磺酰脲類除草劑殘留量的加速溶劑提取、凝膠滲透色譜法凈化、UPLC-MS/MS定性定量的方法。方法檢出限為2～5 ng/kg，并應(yīng)用本方法對(duì)中部某省農(nóng)用地土壤詳查樣品進(jìn)行了監(jiān)測(cè)分析。結(jié)果顯示，不同程度檢出了該類除草劑。該方法能有效、靈敏、準(zhǔn)確地對(duì)農(nóng)用地土壤中磺酰脲類除草劑監(jiān)測(cè)檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

真空冷凍干燥機(jī)(LGJ-25，北京四環(huán)科學(xué)儀器)；臺(tái)式鄂式破碎儀(JC6，北京格瑞德曼)；超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜Waters TQ-S(Waters公司，美國(guó))；定量平行濃縮儀(MultiVap-8，北京萊伯泰科)；加速溶劑萃取儀(ASE350 Thermo SCIEIVTIFIC，美國(guó))；凝膠滲透色譜儀(GPC ultra，LC Tech?，德國(guó))；超純水制備儀(Millipore Milli-Q Integral15，美國(guó))；Waters BEH C18色譜柱,50 mm×2.1 mm×1.7 μm。

20種磺酰脲類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于瑞士，SIGMA公司，純度≥99.9%。丙酮、甲酸、甲醇、乙腈(農(nóng)殘級(jí)，Merk公司)；超純水；0.22 μm有機(jī)濾頭(尼龍)。

1.2 樣品的采集與制備

采集2 kg新鮮土壤樣品于棕色廣口玻璃瓶中，在4 ℃冷藏保存。樣品經(jīng)真空冷凍干燥(-40 ℃，5 Pa，12 h)后，研磨粉碎過0.24 mm孔徑篩。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的提取

加速溶劑儀提取：準(zhǔn)確稱取20.00 g制備好的樣品于66 mL萃取小池中，用丙酮與乙腈體積比4∶1的溶液，于100 ℃靜置萃取5 min。循環(huán)提取2次，然后用氮?dú)獯祾?0 s整個(gè)管路，收集提取液，于40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用10 mL乙酸乙酯與環(huán)己烷體積比1∶1溶液溶解，待凈化。

1.3.2 樣品的凈化

凝膠滲透色譜儀凈化過程：取上述提取液進(jìn)凝膠色譜系統(tǒng)。凈化柱：S-X3 Bio-Beads填料，粒徑38～75 μm,300 mm×10 mm(內(nèi)徑)，流速5 mL/min，淋洗液為乙酸乙酯-環(huán)己烷體積比1∶1；棄去0～14 min淋洗液，收集14～27 min淋洗液。將收集的洗脫液于40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，準(zhǔn)確用初始流動(dòng)相定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾頭(尼龍)過濾后，待高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

超高效液相色譜條件：色譜分離采用線性梯度洗脫。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為超純水-0.1%甲酸。采用線性梯度洗脫條件，見表1。 進(jìn)樣量為 10 μL，流速0.4 mL/min，樣品室溫度10 ℃；色譜柱溫：40 ℃。

表1 液相色譜線性梯度洗脫條件Table 1 Linear gradient elution conditions of liquid chromatography

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式進(jìn)行檢測(cè)，監(jiān)測(cè)模式為多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。噴射電壓1.5 K，源溫度為200 ℃，脫溶劑氣溫度為400 ℃，流量為850 L/h，錐孔氣流速為150 L/h，錐孔電壓和碰撞能經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化見表2。

表2 20種磺酰脲類除草劑英文名稱、CAS號(hào)、監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量Table 2 The English name, CAS number, ion pair monitoring and collision energy of 20 sulfonylurea herbicides

注：“*”表示定量離子對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理方法的優(yōu)化選擇

目前關(guān)于環(huán)境土壤樣品的前處理方式，大都采用風(fēng)干干燥的方法，但是由于其需要大量時(shí)間而可能導(dǎo)致目標(biāo)物的降解損失。因此我們選擇了相對(duì)快速的真空冷凍干燥法，可以快速對(duì)土壤進(jìn)行干燥。對(duì)于干燥研磨好后的樣品，目前提取方法大多為液-液萃取、超聲萃取、加速溶劑萃取(ASE)等方法。考慮到快速簡(jiǎn)便提高萃取效率，我們嘗試選用了加速溶劑萃取(ASE)的提取方式，提取效率較文獻(xiàn)[5-11]中提到的超聲提取法提高了12%～25%。

2.1.2 提取溶劑的優(yōu)化選擇

由于土壤樣品基體復(fù)雜，基質(zhì)成分與目標(biāo)化合物的含量相差懸殊，同時(shí)在進(jìn)行藥物多殘留分析過程中，由于所分析的目標(biāo)化合物的物理化學(xué)性質(zhì)存在較大差別，選擇合適的萃取溶劑對(duì)獲得多種化合物滿意的回收率、最大程度降低共萃取的基體雜質(zhì)成分至關(guān)重要。為了減弱磺酰脲類質(zhì)與土壤基質(zhì)之間相互作用，本文比較丙酮、甲醇、乙腈、磷酸鹽緩沖液等溶劑的提取效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：甲醇、乙腈或甲醇乙腈混合溶劑提取時(shí)氟磺隆、吡啶磺隆、氯嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、氟胺磺隆、甲基氟嘧磺隆、環(huán)丙嘧磺隆這7種目標(biāo)物的回收率較低(只有45～70%)，其他目標(biāo)物回收率在70%以上。而丙酮與乙腈體積比4∶1的溶液作為提取溶劑，20種磺酰脲類除草劑回收率為75%～110%。不同提取溶劑的磺酰脲類除草劑提取效果見圖1。最終選擇丙酮與乙腈體積比4∶1的溶液作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的磺酰脲類除草劑回收率Fig.1 Recovery rates of sulfonylurea herbicides from different extraction solvents

2.1.3 凈化方法的優(yōu)化選擇

土壤樣品基體復(fù)雜，在上述提取條件下得到的樣品溶液中，含有基體干擾雜質(zhì)，尤其是含有大量的色素、有機(jī)腐殖酸、微生物動(dòng)物腐殖蛋白等干擾，對(duì)液相色譜的進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱以及質(zhì)譜的離子源等部件都會(huì)造成一定的污染，使其使用性能下降。如何對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，在保證回收率的前提下，獲得較高的基體凈化度，盡可能去除雜質(zhì)干擾，就成為分析方法的關(guān)鍵問題。

目前文獻(xiàn)報(bào)道磺酰脲類除草劑凈化方法有QuEChERS法、固相萃取(C18、HLB、ENVI-CARB)等。QuEChERS法分別比較了4種不同填料配比萃取管：第1種MgSO4150 mg、PSA 50 mg、C1850 mg；第2種MgSO4150 mg、PSA 25 mg、C1825 mg；第3種MgSO4150 mg、PSA 25 mg；第4種MgSO4150 mg、PSA 50 mg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氟磺隆、吡啶磺隆、氯嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、氟胺磺隆、甲基氟嘧磺隆、環(huán)丙嘧磺隆這幾種物質(zhì)的回收率較差，只有20%～40%，部分磺酰脲的回收率達(dá)到150%以上，這主要因?yàn)橥寥阑|(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)。同樣3種固相萃取柱(C18、HLB、ENVI-CARB)回收率無法同時(shí)滿足20種磺酰脲類除草劑的殘留檢測(cè)。

最終本實(shí)驗(yàn)選擇了針對(duì)土壤、沉積物基質(zhì)干擾物質(zhì)(色素、有機(jī)腐殖酸、微生物、動(dòng)物腐殖蛋白等)能有效去除的凝膠滲透色譜法(GPC)作為凈化條件。使用該方法檢測(cè)20種磺酰脲類除草劑的殘留量的回收率為70%～120%，優(yōu)于相關(guān)文獻(xiàn)凈化條件。因?yàn)楸緲?biāo)準(zhǔn)研究對(duì)象為磺酰脲類除草劑，相對(duì)分子質(zhì)量集中在300～500之間，GPC的分離原理與固相萃取小柱的主要區(qū)別：固相萃取小柱是利用填料、樣品和淋洗劑之間極性的差別來達(dá)到分離的目的，而凝膠色譜儀則是利用化合物中各組分分子大小不同而淋出順序先后也不同而達(dá)到分離目的的，淋洗溶劑的極性對(duì)分離的影響并不起決定作用，對(duì)于凈化脂肪酸、色素較多的樣品具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

目標(biāo)物在GPC柱上的流出規(guī)律必須進(jìn)行研究以確定合適的收集方式。因此本研究采用基質(zhì)加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，分段收集的方式，經(jīng)氮吹處理后供液質(zhì)分析，以確定磺酰脲類除草劑在GPC柱上的流出規(guī)律，從而確定收集時(shí)間段。分段收集數(shù)據(jù)如圖2所示，磺酰脲類除草劑主要集中在14～27 min中流出，獲得較好的凈化效果。

圖2 14～29 min GPC柱目標(biāo)物流出質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of GPC column objective logistics at 14 to 29 min

2.2 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別比較了不同類型的反相色譜柱(Waters BEH C18, Waters HSS T3, Waters HSS C8)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的色譜分離效果。我們發(fā)現(xiàn)Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)上獲得了20種磺酰脲類除草劑較為理想的分離效果，詳見圖3。

由于目標(biāo)物的弱酸性質(zhì)，在正離子電離模式下溶液中能夠電離出H+。所以，在流動(dòng)相中適當(dāng)加入酸性物質(zhì)可以促進(jìn)目標(biāo)物的電離，從而獲得較高的離子化效率。因此，本文選取0.1%甲酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并獲得了最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。選擇梯度洗脫方式，優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫條件，在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)化合物的快速分離測(cè)定。

1.煙嘧磺隆； 2.甲酰胺磺隆； 3.環(huán)氧嘧磺隆； 4.甲基噻吩磺隆； 5.甲磺隆； 6.醚磺隆； 7.醚苯磺隆； 8.氯磺隆； 9.胺苯磺隆； 10.四唑嘧磺隆； 11.甲磺胺磺隆；12.三氟啶磺隆；13.丙苯磺隆；14.氟磺隆；15.吡啶磺隆；16.氯嘧磺隆；17.乙氧嘧磺隆；18.氟胺磺隆；19.甲基氟嘧磺隆；20.環(huán)丙嘧磺隆圖3 20種磺酰脲類除草劑多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of 20 kinds of sulfonylurea herbicides

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)目標(biāo)物的化學(xué)電離性質(zhì)，本文選用正電離模式(ESI+)，采用蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣的方式進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。根據(jù)CAC和EU第657/2002/EEC號(hào)決議有關(guān)規(guī)定，選擇2對(duì)離子監(jiān)測(cè)MRM即可滿足。通過儀器自帶軟件Masslynx4.1的自動(dòng)優(yōu)化軟件IntelliStart，對(duì)目標(biāo)物的錐孔電壓、碰撞能、定量離子和輔助定性離子進(jìn)行了優(yōu)化和確定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用初始流動(dòng)相梯度稀釋成6種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5、1、5、10、20、50 μg/L)。然后上機(jī)用本方法測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。并根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2010)中方法檢出限的一般確定方法，依據(jù)公式通過重復(fù)空白實(shí)驗(yàn)7次計(jì)算得各組分最低檢測(cè)濃度，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，本方法的檢出限優(yōu)于現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)[5]。在0.5～50 μg/L范圍內(nèi)目標(biāo)化合物取得了較好的線性，并且相關(guān)系數(shù)r≥0.995。

表3 20種磺酰脲類除草劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 3 Linear range, linear equation, correlation coefficient and detection limit of 20 kinds of sulfonylurea herbicides

2.4 方法的回收率與精密度

對(duì)一已知實(shí)際環(huán)境土壤樣品(未檢出目標(biāo)物)進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，樣品分別添加低、中、高(1、5、10 μg/L)3種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)添加濃度平行測(cè)定6次，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD)，按本方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。方法回收率在65.7%～106.1%之間，精密度在2.3%～12.1%之間，結(jié)果見表4。

表4 20種磺酰脲類除草劑的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率(n=6)Table 4 Relative standard deviation and marking recovery rate of 20 benzoylurea herbicides (n=6)

2.5 樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)中部某省農(nóng)用地土壤詳查近2 000組樣品進(jìn)行了分析測(cè)定。分析結(jié)果表明，其中有120組樣品中檢出了甲酰胺磺隆、甲磺隆、氯磺隆、甲磺胺磺隆、氟胺磺隆和甲基氟嘧磺隆等幾種除草劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.5～217.4 ng/kg。

3 結(jié)論

建立了加速溶劑提取、凝膠滲透色譜法凈化-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定土壤中20種磺酰脲類除草劑的方法。土壤經(jīng)過冷凍干燥、粉碎過篩，用加速溶劑儀提取，經(jīng)凝膠滲透色譜凈化，以超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)多級(jí)監(jiān)測(cè)模式(MRM)外標(biāo)法進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，具有靈敏、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可以作為土壤中衡量磺酰脲類除草劑的監(jiān)測(cè)方法。