共振瑞利散射法和分光光度法快速測定3種細菌懸液的濃度

曹凱欣，邱佩佩，賀錦燦，鄒志輝，白研，毋福海

(廣東藥科大學公共衛生學院，廣東 廣州 510310)

在藥品、食品等微生物實驗中，標準細菌懸液的制備是最基本的工作，快速確定細菌懸液濃度能提高微生物實驗中實驗評估及結果分析效率，而且能為細菌的分離鑒定及細菌藥敏試驗提供更好的數據支撐。目前，細菌懸液濃度的測定方法主要為比濁法[1-2]和平皿計數法[3-4]，但比濁法用到的比濁儀在實驗室中并不普及，標準比濁管的使用不方便，平皿計數法的操作復雜、耗時長，嚴重影響實驗的進度及效率。

共振瑞利散射(resonance Rayleigh scattering，RRS)技術是20世紀90年代發展起來的光譜分析技術[5]，具有快速、靈敏度高等優點，在藥物、生物、環境等多個學科領域的分析研究中具有重要的應用[6-7]。已有研究報道，金黃色葡萄球菌和大腸埃氏菌能產生相似的RRS信號[8-9]，RRS法也用于細菌的間接鑒別[10]，但用RRS法檢測細菌懸液濃度鮮見報道。

分光光度法是通過檢測物質在被特定波長的光照射下的吸收強度，并對該物質進行定性和定量分析的方法[11-12]。分光光度法具有儀器簡單、操作簡便等優點。細菌懸液具有一定的濁度，對光具有一定的吸收，因此可以通過測定細菌懸液在某個波長下的吸光度值反映細菌懸液的濃度[13]。

食源性致病菌是一類以食品為傳播媒介的致病性細菌，也是引起食源性疾病和食物中毒的主要原因。致病菌所引起的食源性疾病暴發案例占大多數，是食品安全的重大隱患，建立食源性致病菌的快速分析方法具有重要意義，而食源性致病菌懸液的快速計數是提高實際樣品中細菌檢測速度的前提。副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌是3種典型的食源性致病菌，也是《中國藥典》常見的檢定細菌。本研究針對常規細菌計數方法的不便，以副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌為例，考察細菌濃度與RRS值、吸光度值的關系，建立快速測定細菌懸液的RRS法和分光光度法，并對2種方法的優缺點進行比較，為細菌懸液的實際應用提供依據。

1 儀器與試劑

LRH-250生化培養箱(上海一恒科技有限公司)；VM-03RU迷你渦旋混勻器(蘇州捷美電子有限公司)；WGZ-XT細菌濁度儀(杭州齊威儀器有限公司)；F-2500熒光分光光度計(日本日立公司)；U-3010紫外可見分光光度計(日本日立公司)；721-100分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

營養瓊脂培養基(批號1066111，廣東環凱微生物科技有限公司)；NaCl(99.5%，廣州化學試劑廠)；生理鹽水(0.9% NaCl水溶液，使用前滅菌處理)；副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[ATCC17802]，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[ATCC6538]，沙門氏菌(Salmonella)[CMCC (B) 50071]，菌種均購自廣東省微生物研究所。所有供試菌經過增菌培養和選擇性培養基分離培養后進行涂片染色鏡檢，在此基礎上，副溶血性弧菌再結合耐鹽試驗和移種MIU培養基進行生化反應鑒定，金黃色葡萄球菌通過血漿凝固酶試驗和血平板上形成明顯的β溶血環進行鑒定，沙門氏菌則通過克氏雙糖(KIA)復合試驗和A～F群O多價血清凝集試驗進行鑒定。

2 方法

2.1 細菌懸液的制備

不同濁度的細菌懸液[13]：接種副溶血性弧菌，金黃色葡萄球菌與沙門氏菌的新鮮培養物至斜面培養基(營養瓊脂培養基+3% NaCl制得)，于37 ℃生化培養箱內培養24 h，用生理鹽水將3種細菌的斜面培養物配成麥氏濁度為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的細菌懸液。

系列濃度的細菌懸液[13]：將3種細菌培養物用生理鹽水制成的初始細菌懸液，用平皿計數，并進行1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128的倍比稀釋，制成系列濃度的細菌懸液。

2.2 RSS法測定細菌懸液濃度

以生理鹽水為空白對照液，依次在F-2500型熒光分光光度計上以λex=λem的模式進行同步掃描，在30 min內完成測定，記錄470 nm處[8]空白試劑的RRS強度I0和細菌懸液的RRS強度IRRS，并計算變化量ΔIRRS(ΔIRRS=IRRS-I0)。

2.3 分光光度法測定細菌懸液濃度

分別取不同麥氏濁度及不同濃度的3種細菌的菌懸液，以生理鹽水為空白對照液，依次測定在650 nm波長處的吸光度[13]。

3 結果

3.1 RSS法測定3種細菌懸液濃度

3.1.1 3種細菌的共振散射光譜 用生理鹽水將副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的斜面培養物制成初始菌懸液，以生理鹽水為空白對照液，在F-2500型熒光分光光度計上以λex=λem的模式同步掃描RRS光譜，結果見圖1?？梢?，3種細菌懸液均能產生RRS信號，RRS光譜具有一定的區別，在470 nm處均產生1個較強的RRS峰。將副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的懸液放置不同時間(0、10、20、30、40、50、60 min)，檢測470 nm處的RRS值隨放置時間的變化情況，結果表明：當放置時間在30 min內時，3種細菌懸液在470 nm處的RRS值變化率(與0 min比較)分別為-6.4%～1.7%、-4.1%～3.1%、-5.8%～2.3%；超過30 min時，RRS值顯著下降，下降率超過15%。因此，制備的細菌懸液需控制在30 min內完成測定。

70006000500040003000200010000IRRS470nmVibrioparahaemolyticusStaphylococcusaureusSalmonella300400500600λ/nm

圖13種細菌懸液的RRS譜圖
Figure1RRS spectra of three kinds of bacterial suspension

3.1.2 菌懸液散射值與麥氏濁度的關系 取不同麥氏濁度的副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌懸液，以生理鹽水為空白對照液，在F-2500型熒光分光光度計上以λex=λem的模式同步掃描RRS光譜。以麥氏濁度為橫坐標，以470 nm處的RRS差值ΔIRRS為縱坐標、麥氏濁度(c)為橫坐標作圖，結果見圖2?？梢姡準蠞岫仍?.4～0.8范圍時，3種細菌懸液的麥氏濁度與散射值變化量存在良好的線性關系，線性回歸方程分別為ΔI=1 610c+1 500.6、ΔI=1 684c+1 280.0、ΔI=1 273c+1 443.4，相關系數r值分別為0.990 9、0.990 8、0.984 5；副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌的斜率接近，而沙門氏菌的斜率略低。

300027002400210018001500ΔIRRS0.30.40.50.60.70.80.9麥氏濁度VibrioparahaemolyticusStaphylococcusaureusVibrioparahaemolyticus

圖23種細菌懸液的散射值變化量與麥氏濁度的線性關系圖

Figure2The linear graph between the variation of scattering value and McGrady turbidity of three kinds of bacterial suspension

3.1.3 細菌懸液濃度與散射值的關系 按“2.1”項下的方法配制系列濃度的細菌懸液，以生理鹽水為空白對照液，測定不同稀釋度菌液的RRS光譜，結果見圖3a、3c、3e所示；再分別記錄470 nm處的RRS值，以細菌懸液濃度為橫坐標、470 nm處的RRS差值ΔIRRS為縱坐標作圖，結果見圖3b、3d、3f所示。從圖3可見，副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的菌懸液濃度(c)分別在0.040×107～1.3×107、0.17×108～5.5×108、0.15×108～4.9×108cfu/mL范圍內與470 nm處的散射值變化量(ΔIRRS)呈良好的線性關系，線性回歸方程分別為ΔIRRS=4 655.8c+181.11、ΔIRRS=1 798.6c+370.28、ΔIRRS=1 440.1c+234.92，相關系數r值分別為0.999 8、0.998 7、0.999 4；金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的斜率相近，而副溶血性弧菌的斜率比前兩者大；通過計算，檢出限分別為2.6×104、9.5×105、2.1×106cfu/mL。

3.2 分光光度法測定3種細菌懸液濃度

3.2.1 3種細菌懸液的紫外-可見吸收光譜 副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的紫外-可見光譜見圖4所示?？梢?，3種細菌的紫外-可見光譜相似，在紫外區均具有1個強吸收峰，而在可見區無吸收峰。

3.2.2 3種細菌懸液吸光度與麥氏濁度的關系 取不同麥氏濁度的副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌懸液，以生理鹽水為空白對照液，按照《中國藥典》二部附錄的紫外可見分光光度法，測定650 nm波長處吸光度。以麥氏濁度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標作圖，結果顯示：在麥氏濁度為0.4～0.8的范圍內，3種細菌懸液的麥氏濁度與吸光度均存在良好的線性關系，回歸方程分別為A=0.423c+0.054、A=0.555c-0.046、A=0.514c+0.001，相關系數r值分別為0.991 5、0.992 0、0.996 5；不同細菌的回歸方程的斜率有所不同。

3.2.3 細菌懸液吸光度與濃度的關系 按“2.1”項下方法配制系列濃度的細菌懸液，以生理鹽水為空白對照液，測定不同稀釋度菌液在650 nm處的吸光度。以細菌懸液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，擬合線性曲線，結果見表1?？梢?，副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌3種細菌的菌懸液的濃度分別在0.27×107～8.7×107、0.30×108～9.7×108、0.34×108～11×108cfu/mL范圍內與吸光度呈較好的線性關系，相關系數r值分別為0.999 6、0.999 8、0.999 8；金黃色葡萄球菌與沙門氏菌的斜率相近，副溶血性弧菌的斜率略高；通過進一步計算，檢出限分別為0.10×106、7.5×106、8.5×106cfu/mL。

61616180006000400020000AB80006000400020000300400500600λ/nm0.30.60.91.21.50細菌濃度/(?107cfu?mL-1)10000800060004000200001000080006000400020000800060004000200001000080006000400020000D300400500600λ/nm300400500600λ/nm0123450123456CEFIRRSΔIRRS細菌濃度/(?107cfu?mL-1)細菌濃度/(?107cfu?mL-1)

A.不同濃度下副溶血性弧菌的RRS譜圖(1～6分別為0.040×107,0.080×107,0.16×107,0.32×107,0.65×107,1.3×107cfu/mL)； B.副溶血性弧菌的濃度與RRS譜圖470 nm處強度的線性關系圖； C.不同濃度下金黃色葡萄球菌的RRS譜圖(1～6分別為0.17×108,0.34×108,0.68×108,1.4×108,2.7×108,5.5×108cfu/mL)； D.金黃色葡萄球菌的濃度與RRS譜圖470 nm處強度的線性關系圖； E.不同濃度下沙門氏菌的RRS譜圖(1～6分別為0.15×108,0.30×108,0.61×108,1.2×108,2.4×108,4.9×108cfu/mL)； F.沙門氏菌的濃度與RRS譜圖470 nm處強度的線性關系圖。

圖3不同濃度下3種細菌懸液的RRS圖及線性關系圖(470 nm)
Figure3RRS spectra of three kinds of bacterial suspension with different concentrations and the linear relationship (470 nm)

VibrioparahaemolyticusStaphylococcusaureusSalmonella3.52.82.11.40.70.0300400500600700800λ/nmA

圖43種細菌懸液的紫外吸收光譜圖

Figure4The absorption spectra of three kinds of bacterial suspension

3.3 平皿計數法、RRS法和分光光度法測定細菌懸液濃度的結果比較

為了驗證方法的準確性，將RRS法和分光光度法(標準曲線法)應用于麥氏濁度為0.5的細菌懸液濃度的測定，并與平皿計數法進行比較，結果見表2?？梢?，以平皿計數法為參考，RRS法的相對誤差為-6.3%～9.2%，分光光度法的相對誤差為-6.7%～7.8%，2種方法的相對誤差均在±10%以內，說明RRS法、分光光度法與平皿計數法結果的符合度較高。

表1 分光光度法測定3種細菌懸液的方法特性Table 1 The analytical performance of determination of three bacterial suspension by spectrophotometry

表2 3種方法測定3種細菌懸液濃度Table 2 Determination of three kinds of bacterial suspension with three different methods (n=3)

4 討論

本文以副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌為例，建立了快速測定3種細菌懸液的RRS法和吸光光度法。RRS法測定細菌懸液表面攜帶的電荷且存在界面能帶，在470 nm入射光激發下，一部分細菌菌體的界面分子吸收光子及發生能量轉移而產生散射光，從而產生一定強度的RRS信號[9]。RRS信號隨著細菌懸液濃度的增大而增強，在一定范圍內兩者間呈現線性相關性，因此可以通過測定特定波長(如470 nm)處細菌懸液的散射值確定其濃度。該方法檢出限低，菌懸液在1×104cfu/mL以上即可檢出；但RRS法的測定結果受測定時間的影響較大，需在30 min內測定完畢。在一定范圍內，細菌懸液的濃度與吸光度值之間存在良好的線性關系，因此可以通過測定的吸光度值確定細菌懸液濃度，該方法操作簡便、快速、穩定，但靈敏度較RRS法低。用分光光度法測定細菌懸液濃度時，菌落總數宜在105～108cfu/mL之間，否則會偏離朗伯—比爾定律，導致結果不準確。此外，細菌死亡可能導致濁度增加，從而引起吸光度增加[14]，產生假陽性結果。為了排除該假陽性，在分析前可以先取一部分菌液進行美藍(或剛果紅、中性紅等無毒染料)染色[15]，分辨細菌是活菌還是死菌，再進行后續分析。

總之，RRS法和吸光光度法可用于細菌懸液的快速測定，為藥品、食品等微生物實驗技術人員提供便捷、普適性的檢測技術，具有一定的實用性。