循環腫瘤細胞檢測對胃癌新輔助化療療效的評估價值

付漢東，寇繼光，劉漢中，張愛華，王雪菲，陽仕雄，胡校云，沈婷，魯艷，魏威

(湖北省孝感市中心醫院/武漢科技大學附屬孝感醫院中心實驗室，湖北 孝感 432100)

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，具有較高的發病率和死亡率。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NAC)是胃癌綜合治療的重要部分，可有效提高胃癌患者手術根治率，若在NAC進程中能及時評估治療效果，進而指導調整化療方案，有利于胃癌的精準個體化治療。臨床上胃癌患者的治療效果主要依靠病理評價和影像學檢查進行評估，但前者具有明顯的有創性、滯后性，后者缺乏特異性，準確率低。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)于1869年被澳大利亞學者Ashworth首次提出，是指自發或因診療操作由原發腫瘤或者轉發性病灶脫落進入血液循環系統的腫瘤細胞[1]。近年來，已有較多研究[2-3]表明CTCs在多種腫瘤的早期診斷、預后評估等具有重要的臨床意義，但目前關于CTCs評估胃癌NAC療效的研究較少，且存在爭議。本課題采用差異富集-熒光免疫染色原位雜交技術(Subtraction Enrichment-Immunofluorescence in situ hybridization,SE-iFISH)檢測胃癌患者外周血中的CTCs，旨在探討CTCs檢測在胃癌患者NAC療效評估中的價值。現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月—2018年10月我院收治的胃癌患者，納入標準：①術前經胃鏡活檢病理證實為胃惡性腫瘤，診斷參照《中華人民共和國衛生行業標準：胃癌診斷標準(WS316-2010)》[4]；②TNM分期為Ⅲ期；③入組前未接受任何輔助性治療；④有術前新輔助化療指征，并在我院接受新輔助化療；⑤本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者自愿參加并簽署書面知情同意書。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②具有化療禁忌證；③因病情出現變化或患者依從性差，不能按既定方案進行新輔助化療。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 胃癌患者接受FOLFOX4方案進行新輔助化療，d1：注射用奧沙利鉑85 mg/m2靜脈滴注，>2 h；注射用亞葉酸鈣200 mg/m2靜脈滴注，>2 h；氟尿嘧啶注射液400 mg/m2靜脈推注，<30 min，然后600 mg/m2持續靜脈泵入，5 mL/h。d2：注射用亞葉酸鈣200 mg/m2靜脈滴注，>2 h；氟尿嘧啶注射液400 mg/m2靜脈推注，<30 min，然后600 mg/m2持續靜脈泵入，5 mL/h。14 d為1個周期，共接受2個周期。所有患者均于化療結束4周后行胃癌根治術，且手術順利，無明顯并發癥。

1.2.2 病理觀察及化療效果判定 詳細記錄胃癌患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、組織分化程度。手術切除瘤體后進行病理檢查，依據病理學Miller-Payne評定標準評估NAC療效，根據殘留腫瘤細胞的百分比分為Ⅰ～Ⅴ級，以Ⅲ～V級定義為化療有效，Ⅰ～Ⅱ級定義為化療無效[5]。

1.2.3 CTCs檢測 胃癌患者分別于化療前、化療后清晨空腹狀態下采集外周血6 mL，棄去穿刺后的前2 mL，以避免穿刺過程中皮膚上皮細胞的污染而造成的假陽性結果。采集所得的血樣置于EDTA抗凝管中，輕柔顛倒2～3次混勻，常溫避光靜置保存，采集后5 h內處理標本。通過SE-iFISH技術檢測胃癌患者外周血CTCs，人外周循環腫瘤細胞鑒別試劑盒購自北京萊爾生物醫藥科技有限公司。CTCs判定標準為細胞核4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色陽性，上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)染色陽性或陰性，8號染色體著絲粒探針(centromeric probe 8,CEP8)染色陽性的信號點≥3個，檢測到3個以上CTCs即為CTCs陽性[6]。胃癌患者以NAC前后CTCs檢出數目降低定義為化療有效，NAC前后CTCs數目不變或者升高定義為化療無效[7]。

1.3 質量控制

①嚴格按照納入標準、排除標準納入研究對象；②胃癌患者治療效果均由經驗豐富的腫瘤外科醫生依據相關標準進行評定；③胃癌患者組織病理學檢查、CTCs檢測均由我院經驗豐富的同組檢驗科醫生進行；④所有研究數據均詳細記錄，錄入前進行核對、補漏，錄入員采用雙軌錄入法錄入數據資料，確保所有數據的可靠性和真實性。

1.4 統計學數據處理

2 結果

2.1 胃癌患者的臨床病理特征

本研究共納入90例胃癌患者。①性別：男59例(65.56%)，女31例(34.44%)；②年齡：27～74歲，平均(53.91±14.67)歲，其中>50歲共48例(53.33%)、≤50歲42例(46.67%)；③腫瘤位置：胃竇38例(42.22%)，其他52例(57.78%)；④ 腫瘤浸潤深度：T1-212例(13.33%)、T3-478例(86.67%)；⑤ 淋巴結轉移：N030例(33.33%)、N1-360例(66.67%)；⑥組織分化程度：低分化26例(28.89%)、中分化31例(34.44%)，高分化33例(36.67%)；⑦ 病理分期ⅢA期37例(41.11%)、ⅢB期31例(34.44%)、ⅢC期22例(24.45%)。

2.2 NAC前胃癌患者CTCs檢出情況及其與臨床病理特征的關系

NAC前胃癌患者外周血CTCs陽性率為86.67%(78/90)，在腫瘤浸潤深度T3-4及淋巴結轉移N1-3患者中CTCs檢出率更高，與患者性別、年齡、腫瘤位置、組織分化程度、病理分期無關(P>0.05)。見表1。

表1 NAC前CTCs檢出情況及其與胃癌患者臨床病理特征的關系

Table1Detection of CTCs before NAC and its relationship with clinicopathological features of patients with gastric cancer [n(%)]

病理特征例數CTCs陽性(n=78)陰性(n=12)χ2值P值性別0.5470.460 男5950(64.10)9(75.00) 女3128(35.90)3(25.00)年齡/a0.9890.320 ≤504238(48.72)4(33.33) >504840(51.28)8(66.67)腫瘤位置0.0020.967 胃竇3833(42.31)5(41.67) 其他5245(57.69)7(58.33)腫瘤浸潤深度4.7930.029 T1-2128(10.26)4(33.33) T3-47870(89.74)8(66.67)淋巴結轉移6.9230.009 N03022(28.21)8(66.67) N1-36056(71.79)4(33.33)組織分化程度1.0070.316 低分化2624(30.77)2(16.67) 中、高分化6454(69.23)10(83.33)TNM分期1.4850.223 ⅢA期3734(43.59)3(25.00) ⅢB、ⅢC期5344(56.41)9(75.00)

2.3 NAC前后胃癌患者CTCs的變化情況

與NAC前比較，胃癌患者NAC后CTCs陽性率明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 CTCs檢測對胃癌評價NAC療效的研究評估價值

90例胃癌患者NAC治療總有效率為75.56%(68/90)。NAC前后CTCs檢出數目降低、不變或升高評估療效的敏感度、特異度、準確性分別為88.24%、68.18%、83.33%。CTCs檢測評價結果與金標準評估療效中度一致(Kappa=0.556,P<0.001)。見表3。

表2 胃癌患者NAC前、NAC后CTCs的比較(n=90)

Table2Comparison of CTCs between before and after NAC in patients with gastric cancer (n=90)

NAC例數CTCs陽性陰性χ2值P值NAC前90781229.4060.000NAC后904446

表3 CTCs檢測與病理學Miller-Payne標準評估胃癌患者NAC療效的比較(n=90)

Table3Comparison of evaluating value on efficacy of NAC in patients with gastric cancer between CTCs detection and pathology Miller-Payne criteria (n=90)

CTCs檢測Miller-Payne標準有效無效合計有效60767無效81523合計682290

3 討論

在惡性腫瘤患者的外周血中，只有極少數CTCs，幾乎每10～100萬個白細胞中只有1個CTCs，因此對CTCs檢測技術的靈敏性和特異性均提出了極高要求[8]。與CellSearch系統等通過檢測EpCAM的CTC的傳統方法相比，陰性富集法與熒光免疫染色原位雜交技術相結合，可避免因上皮細胞向間質細胞轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)導致的CTCs假陰性結果，且可有效鑒別非血源性染色體數目異常的CTCs，明顯提高陽性率[9-10]。本研究應用這種方法檢測了90例胃癌患者外周血CTCs，結果顯示CTCs陽性率為86.67%(78/90)，與國內相關文獻[11]報道接近。

目前研究[12]表明，部分惡性腫瘤患者在早期階段即可出現腫瘤細胞于原發灶脫落進入血液循環形成CTCs，且惡性程度越高的惡性腫瘤患者血液循環中CTCs數目越多，但CTCs數目與腫瘤惡性程度的關系尚未完全明確。孫建兵等[11]研究提到胃癌患者空腹外周靜脈血中CTCs水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關。Okabe等[13]研究也提到CTCs陽性率與TNM分期、腫瘤分化程度有關。然而，本研究對CTCs檢出情況與胃癌患者臨床病理特征的關系進行分析，發現CTCs陽性率與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移顯著相關，但與患者性別、年齡、腫瘤位置、組織分化程度、病理分期無關，這與上述研究結果不符，分析其原因可能與CTCs檢測方法不同、納入研究樣本數量的差異有關，但總體反映了CTCs檢出情況與腫瘤惡性程度有關。

病理評價是評估療效的金標準，但該法存在明顯的有創性、滯后性，不能及時反映原發腫瘤對NAC的反應[14]。NAC后惡性腫瘤患者CTCs變化是否與NAC療效有關，目前國內外尚未取得統一的結論。Serrano等[15]發現，NAC后持續存在的CTCs與原發腫瘤患者臨床獲益與否無直接關系。Tong Bing等[16]研究也提出基線CTCs數目與晚期非小細胞肺癌化療反應之間無相關性。而Liu等[17]研究表明基線CTCs數目少或化療后CTCs數目減少的晚期胃癌患者可在化療中獲益。本研究結果顯示，NAC后胃癌患者外周血CTCs陽性率較NAC前明顯降低，表明NAC可有效殺滅胃癌患者外周血CTCs。以NAC前后CTCs檢出數目降低和不變或者降低分別定義為化療有效和無效，其評估NAC療效的敏感度、特異度、準確性分別為88.24%、68.18%、83.33%，與金標準評估療效中度一致(Kappa=0.556,P<0.001)，表明CTCs檢測在一定程度上可反映胃癌患者NAC療效。

綜上所述，CTCs檢測有助于評估胃癌的惡性程度，對評價NAC療效具有一定的臨床價值。由于本研究納入研究樣本量相對較少，且未對胃癌患者根治術后轉移、復發等情況進行隨訪，缺乏CTCs檢測與胃癌患者術后預后的關系分析，故今后仍需進一步擴充病例、延長隨訪時間，開展前瞻性、大樣本、多中心的臨床研究進行相關驗證。