HPLC法同時測定炎立消膠囊中5種成分的含量

張妤琳 ，沈曄

(1.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210019； 2.嘉興市第一醫院，浙江 嘉興 314000)

炎立消膠囊是以丁香葉為原料提取制得的膠囊劑，具有清熱解毒、消炎止痢等功效，臨床上用于屬于熱癥的細菌性痢疾、急性扁桃體炎、急慢性支氣管炎、急性腸胃炎、急性乳腺炎等感染性疾病[1-6]。丁香葉為木犀科丁香屬植物紫丁香SyringaoblateLindl.、朝鮮丁香SyringadiatataNakai.或洋丁香SyringavulgarisL.的干燥葉，該屬植物為落葉灌木，在東北地區分布較廣，資源豐富，是庭院綠化的主要樹種。研究表明，丁香葉是一種理想的廣譜抗菌藥，具有顯著的抗菌消炎作用，所含的有效成分主要有有機酸類、苷類以及揮發油等，其中原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、咖啡酸、紫丁香苷、丁香苦苷等具有較強的抑菌作用，為其主要活性物質[7-11]。炎立消膠囊現行的法定標準大部分只有原兒茶酸的含量測定項，且多為紫外分光光度法，專屬性和準確性都較差[12]。目前對炎立消膠囊多組分同時測定的報道較少，且包含的組分不夠全面[13-14]，為進行有效的質量控制，更全面合理地評價該制劑的整體質量，我們建立了HPLC同時測定炎立消膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷和咖啡酸質量分數的方法。

1 儀器與試藥

LC-20AB高效液相色譜儀，LC solution色譜工作站(日本島津公司，PDA檢測器)；KH-700TDB型高頻數控超聲波清洗器(昆山禾超超聲儀器有限公司)；BS21S 型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

原兒茶酸(批號100049-201009，質量分數99.9%)，原兒茶醛(批號110810-201608，質量分數99.3%)，酪醇(批號111676-200602，質量分數100%)，紫丁香苷(批號111574-201605，質量分數95.2%)，咖啡酸(批號110885-201703，質量分數99.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院；炎立消膠囊15批[葵花藥業集團(吉林)臨江有限公司，批號20170201、20170701、20180202；吉林省正和藥業集團股份有限公司，批號170901、171201、180202；通化斯威藥業股份有限公司，批號171001、171201、180101；修正藥業集團股份有限公司，批號171104、180105、180301；黑龍江龍桂制藥有限公司，批號171102、171201、180101]。硬脂酸鎂由葵花藥業集團(吉林)臨江有限公司提供。甲醇、冰醋酸均為色譜純，水為去離子水，其余均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備

分別取原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸對照品25.890、5.105、50.400、25.340、5.083 mg，精密稱定，分別置于100、100、50、100、100 mL容量瓶中，用50%(體積分數，下同)甲醇制成質量濃度分別為0.258 6、0.050 7、1.008 0、0.241 2、0.050 7 mg/mL的對照品儲備溶液。

精密量取原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸各對照品儲備溶液2、5、5、2、1 mL置于50 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，即得質量濃度分別為10.345 6、5.069 3、100.800 0、9.649 5、1.013 6 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品0.5 g，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱定質量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率35 kHz)，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備

炎立消膠囊處方為丁香葉單味藥，取輔料硬脂酸鎂0.5 g，按“2.1.2”項下方法，制得不含丁香葉的陰性對照溶液。

2.2 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agela Durashell RP C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇為流動相A，以1%(體積分數，下同)冰醋酸溶液為流動相B進行梯度洗脫：0～20 min，8%A；20～30 min，8%A→15%A；30～40 min，15%A→20%A；40～50 min，20%A→8%A。流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷檢測波長為275 nm，咖啡酸檢測波長為322 nm。

2.3 系統適用性試驗

分別取“2.1”項下混合對照品、供試品、陰性對照溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣10 μL進行測定。5種成分與相鄰峰之間分離度均大于1.5，陰性對照對測定無干擾，見圖1。

100806040200mAU1008060402001008060402005040302010012435123541015202530354005101520253035400510152025303540051015202530354005ABCDt/mint/mint/mint/min

1.原兒茶酸； 2.原兒茶醛； 3.酪醇； 4.咖啡酸； 5.紫丁香苷；A.對照品溶液(275 nm)； B.對照品溶液(322 nm)； C.供試品溶液(275 nm)； D.供試品溶液(322 nm)。

圖1炎立消膠囊多組分測定的HPLC色譜圖
Figure1HPLC Chromatograms of Yanlixiao capsules

2.4 線性關系的考察

精密量取“2.1.1”項下原兒茶酸對照品儲備溶液0.02、0.2、0.4、2、5、10 mL，原兒茶醛對照品儲備溶液0.1、1、2、5、10、15 mL，酪醇對照品儲備溶液0.5、1、2.5、5、7.5、10 mL，紫丁香苷對照品儲備溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL，咖啡酸對照品儲備溶液0.1、0.2、0.5、1、2.5、5 mL，分別置于50 mL量瓶中，用50%(體積分數，下同)甲醇稀釋至刻度，即得系列混合對照品溶液。精密吸取各混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件下分別進樣10 μL測定，記錄色譜圖。以對照品質量濃度(ρ)為橫坐標，色譜峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的回歸方程分別為A=1.647 5×104ρ-8.770 7×102(r=0.999 9)、A=3.967 9×104ρ-1.396 6×103(r=0.999 9)、A=5.781 1×103ρ+2.826 5×103(r=0.999 9)、A=1.823 0×104ρ-1.617 4×103(r=0.999 9)、A=5.035 3×104ρ+6.700 7×102(r=0.999 9)。結果表明，原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸在0.103 5～51.728 2、0.101 4～15.207 8、10.08～201.6、0.964 9～48.247 4、0.101 4～5.067 8 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 重復性試驗

取同一批炎立消膠囊(批號20170701)，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進樣10 μL測定，原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的質量分數分別為0.507 3、0.034 3、1.963 1、0.704 4、0.204 6 mg/g，RSD值(n=6)分別為0.9%、1.6%、1.6%、1.4%和1.1%，表明本方法重復性良好。

2.6 精密度試驗

取“2.1.1”項下混合對照品溶液(原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸質量濃度分別為10.345 6、5.069 3、100.800 0、9.649 5、1.013 6 mg/mL)，按“2.2”項下色譜條件分別進樣10 μL，連續進樣6次，記錄峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸色譜峰面積的RSD值(n=6)分別為0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、1.4%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取同一批炎立消膠囊(批號20170701)，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.2”項下色譜條件分別進樣10 μL測定，結果原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸色譜峰面積的RSD值(n=8)分別為0.7%、1.1%、0.8%、0.9%、0.8%，表明供試品溶液室溫放置24 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知質量分數的炎立消膠囊(批號20170701，原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸質量分數分別為0.507 3、0.034 3、1.963 1、0.704 4、0.204 6 mg/g)6份，每份精密稱取0.25 g，置錐形瓶中，分別精密加入“2.1.1”項下對照品儲備溶液原兒茶酸0.5 mL、原兒茶醛0.15 mL、酪醇0.5 mL、紫丁香苷0.7 mL、咖啡酸1 mL，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱定質量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率35 kHz)。放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續濾液，即得。原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的平均加樣回收率分別為98.9%、98.8%、101.1%、101.3%、95.2%，RSD值(n=6)分別為2.8%、1.3%、3.0%、4.0%、2.1%，表明方法準確性良好。

2.9 樣品測定

取15批炎立消膠囊，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行制備供試品溶液2份，按“2.2”項下色譜條件分別進樣10 μL測定，按標準曲線法計算炎立消膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的質量分數，結果見表2。

3 討論

炎立消膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的最大吸收波長分別為260、280、275、265、322 nm，綜合考慮，選擇雙波長275、322 nm進行測定。

比較了乙腈-0.1%H3PO4系統和甲醇-1%冰醋酸溶液系統，以及3種色譜柱[Agela Durashell RP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Zorbax SB-Aq C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Phenomex Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)]，結果在使用Agela Durashell RP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱、流動相為甲醇-1%冰醋酸溶液系統梯度洗脫時，5種成分分離最佳，色譜行為良好。

表1 炎立消膠囊中5種成分的加樣回收率結果Table 2 1 The recoveries of five constituents in Yanlixiao capsules (n=6)

表2 炎立消膠囊中5種成分的質量分數測定結果

Table2The content of five constituents in Yanlixiao capsules (n=2)w/(mg·g-1)

編號生產企業批號原兒茶酸原兒茶醛酪醇紫丁香苷咖啡酸S1葵花藥業集團(吉林)臨江有限公司201702010.793 3 0.058 4 3.410 3 1.179 4 0.325 7 S2201707010.507 3 0.034 3 1.963 1 0.704 4 0.204 6 S3201802020.525 3 0.027 4 2.721 6 0.655 4 0.193 8 S4吉林省正和藥業集團股份有限公司1709010.387 7 0.050 8 3.498 6 0.373 2 0.036 4 S51712010.324 4 0.045 1 3.167 0 0.529 5 0.044 3 S61802020.343 7 0.032 9 4.745 2 0.553 5 0.079 1 S7通化斯威藥業股份有限公司1710010.310 9 0.039 6 0.921 7 0.691 7 0.122 8 S81712010.334 0 0.040 0 0.801 3 0.587 6 0.120 9 S91801010.511 9 0.031 2 1.957 0 0.483 2 0.110 6 S10修正藥業集團股份有限公司1711040.281 6 0.038 5 3.865 0 0.384 5 0.102 1 S111801050.315 2 0.023 5 2.566 3 0.435 2 0.075 1 S121803010.398 7 0.030 6 3.122 6 0.362 2 0.072 6 S13黑龍江龍桂制藥有限公司1711020.174 1 0.028 4 0.841 1 0.659 6 0.069 1 S141712010.358 1 0.036 8 1.025 6 0.460 3 0.109 9 S151801010.356 1 0.022 3 1.060 4 0.433 4 0.138 8

比較了不同提取方法(超聲以及加熱回流提取)、不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、80%甲醇)、不同提取時間(15、30、45 min)的提取效果，最終，選擇了50%甲醇超聲提取30 min作為供試品溶液制備方法。

目前,炎立消膠囊的現行標準大多以原兒茶酸做參照，供試品溶液采用索氏提取法制備，采用紫外分光光度法測定，得到的是酚酸類成分的質量分數總和，其專屬性不夠，不能準確全面地表征該制劑各有效成分的質量分數[12]。此外，炎立消膠囊標準中丁香葉來源于3個種(紫丁香、朝鮮丁香、洋丁香)，各個種中原兒茶酸等5種成分的質量分數高低有所不同。從測定結果來看，5種成分的質量分數并非呈現正相關性，而是有高有低，例如S1樣品中原兒茶酸、原兒茶醛、紫丁香苷、咖啡酸的質量分數均最高，而酪醇質量分數略高于均值，S6樣品中酪醇質量分數最高，其余成分則處于均值附近，S12樣品紫丁香苷質量分數最低，但其余4種成分質量分數并不低，處于均值上下，提示我們各成分的質量分數的差異應與各企業投料的丁香葉種屬密切相關。制劑的療效是其各有效成分的協同綜合作用，僅以某一成分來評價顯然不夠合理，本文方法可進一步用來探索丁香葉各個種屬間各有效成分質量分數之間的相關性，從而有效指導投料藥材以及更全面合理有效地評價該產品質量。