雷公藤多苷對人口腔癌KB細胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信號通路的影響

厲婷，周和超，陳駒

(1.廣東醫科大學附屬醫院藥學部,廣東 湛江 524001； 2.廣東醫科大學附屬醫院腫瘤中心,廣東 湛江 524001)

口腔癌是人類頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其引發的并發癥嚴重危害人類健康。據不完全統計，全球平均每年發病人數已達500萬人，其中發展中國家和貧困地區人群是主要的患病人群[1]。有研究表明[2]，晚期口腔癌的患者5年存活率高達30%以上。近年來，隨著全球經濟快速發展，人民生活水平的提高，口腔癌的發病率顯著上升，且發病人群有年輕化的趨勢[3]。目前手術治療是臨床上最有效的治療方法，但由于口腔癌起病相對隱匿，往往發現時已于晚期，錯失了手術治療的最佳時機[4]。此外，化學療法也是口腔癌的重要治療方法，治療藥物有氟尿嘧啶和順鉑等，但現有化療方法不僅毒副作用大，且容易產生耐藥性[5]。故尋找高效低毒的防治口腔癌藥物仍然是科研工作者重中之重的任務。

雷公藤(TripterygiumWilfordiiHook.F)，性寒、味苦，歸心、肝經，其具有消腫止痛、祛風除濕、活血通絡、殺蟲解毒的功效[6]。而雷公藤多苷是從雷公藤去皮根部所提取的總苷類化合物，素有“中草藥激素”的美稱，是我國首次研究利用且具有抗炎免疫調節作用的中藥提取物，現已有藥物上市[7]。雷公藤多苷的生理活性是由多種成分，如生物堿、三萜、二萜內酯等協同產生，它既保留了雷公藤的免疫抑制活性，又去除了許多毒性成分，故在臨床上應用廣泛[8]。目前，雷公藤多苷主要用于治療皮肌炎、多種腎臟疾病、類風濕關節炎、紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病[9]。然而，雷公藤多苷對口腔癌的研究目前尚未見相關實驗報道。本研究旨在探討雷公藤多苷對人口腔癌KB細胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信號通路的影響，初步闡明其作用機制，為雷公藤多苷抗口腔癌的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑

雷公藤多苷片(上海復旦復華藥業有限公司，批號：20180302)；細胞株(人口腔癌KB細胞，上海素爾生物科技有限公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；CCK-8、DMSO、RPMI-1640 細胞培養液(美國Amresco公司)；Annexin V-FITC /PI 凋亡檢測試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒(碧云天生物公司)；p-PI3K抗體、p-AKT抗體(美國Santa Cruz公司)；二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 主要儀器

CO2培養箱(Thermo Fisher Scientific)；Applied Biosystems PCR儀(美國ABI 公司)；BG-sub MIDI 電泳設備(美國Baygene公司)；Sunrise-Basci 酶標儀(瑞士Tecan公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)。

2 方法

2.1 細胞增殖抑制率檢測(CCK-8法)

人口腔癌KB細胞采用含10%(φ)胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養液，于37 ℃、5%(φ)CO2和飽和濕度條件進行常規培養。將處于對數生長期的人口腔癌KB細胞，采用胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度為1×105/mL，以100 μL/孔的體積接種于96孔培養板中。培養24 h后，分別加入雷公藤多苷各濃度處理，使其終濃度分別為20、40、80、160 μmol/L，其中以0 μmol/L設定為對照組，每組6個復孔。繼續培養24、48、72、96 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，并孵育5 h，于450 nm 處測定各組吸光度A值，分別計算雷公藤多苷處理24、48、72、96 h 后的細胞增殖抑制率。增殖抑制率=[1-A藥物處理組/A對照組]×100%

2.2 細胞凋亡檢測(流式細胞法)

將雷公藤多苷處理48 h后的人口腔癌KB細胞，于避光條件下分別加入PI和Annexin V/FITC各5 μL，20 min后，嚴格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒操作說明書步驟，使用流式細胞儀測定雷公藤多苷處理組對人口腔癌KB細胞凋亡率的影響。

2.3 Bcl-2及Bax基因表達檢測(real-time qPCR法)

將不同濃度雷公藤多苷處理48 h后的人口腔癌KB細胞，PBS輕輕沖洗2次，提取細胞總RNA(Trizol法)，并合成cDNA(RT-PCR法)。使用PCR儀檢測Bcl-2及Bax基因表達情況，其中引物序列分別為Bax:F-5′-CGAATTGGCGAT GAACTGGA-3′，R-5′-CAAACATGTCAGCTGCCA CAC-3′;GAPDH:F-5′-GCACAGTCAAGGCTGAGA ATG-3′，R-5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，Bcl-2:F-5′-GACTGAGTACCTGAACCGGCATC-3′，R-5′-CTGAGCAGCGTCTTCAGAGACA-3′。

2.4 p-PI3K和p-AKT蛋白表達檢測(Western blot法)

將雷公藤多苷處理48 h后的人口腔癌KB細胞，先加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，再使用BCA蛋白定量試劑盒定量。吸取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜，10%胎牛血清封閉液封閉3 h，分別加入p-PI3K、p-AKT一抗4 ℃過夜。PBS洗膜3次后加入二抗，室溫孵育2 h，PBS洗膜后使用ECL試劑分別進行化學發光、曝光、顯影、定影。Image J軟件對圖像進行灰度分析，以GAPDH為參照。目的蛋白表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

3 結果

3.1 雷公藤多苷對人口腔癌KB細胞增殖抑制率的影響

從圖1結果可知，20、40、80、160 μmol/L雷公藤多苷給藥組分別處理人口腔癌KB細胞24、48、72、96 h 后，其增殖抑制率均顯著升高，呈濃度和時間依賴性。

3.2 雷公藤多苷對人口腔癌KB 細胞凋亡的影響

從圖2結果可知，對照組及20、40、80、160 μmol/L雷公藤多苷組人口腔癌KB細胞48 h細胞凋亡率分別為(0.59±0.05)%、(9.34±0.84)%、(9.80±1.02)%、(14.25±2.31)%和(19.23±3.68)%; 與對照組比較，經雷公藤多苷處理后的KB 細胞凋亡率均顯著升高(P<0.01) 。

20μmol/L40μmol/L80μmol/L160μmol/L35302520151050-5增殖抑制率/%244872960t/h

圖1雷公藤多苷對人口腔癌KB 細胞增殖抑制率的影響

ABCDE

A.對照組； B.雷公藤多苷20 μmol/L組； C.雷公藤多苷40 μmol/L組； D.雷公藤多苷80 μmol/L組； E.雷公藤多苷160 μmol/L組。

圖2雷公藤多苷對人口腔癌KB細胞凋亡的影響

3.3 雷公藤多苷對人口腔癌KB細胞Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

結果如表1所示，與對照組比較，雷公藤多苷各組Bcl-2 mRNA表達顯著降低，BaxmRNA表達顯著升高(P<0.05或P<0.01)，呈濃度依賴性。

3.4 雷公藤多苷對人口腔癌KB細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達的影響

與對照組比較，雷公藤多苷組細胞的p-PI3K和p-AKT 蛋白表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，呈濃度依賴性。

表1 雷公藤多苷對人口腔癌KB 細胞Bcl-2、BaxmRNA表達的影響

組別劑量/(μmol·L-1)Bcl-2 mRNABax mRNA對照組-0.73±0.130.47±0.03雷公藤多苷組200.58±0.09?0.62±0.06?400.45±0.07??0.76±0.08??800.36±0.08??0.83±0.12??1600.16±0.05??0.96±0.14??

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

12345p-PI3Kp-AKTGAPDH1.00.80.60.40.20.0p-PI3K表達12345**************0.60.40.20.0p-AKT表達AB

1.對照組； 2.雷公藤多苷20 μmol/L組； 3.雷公藤多苷40 μmol/L組； 4.雷公藤多苷80 μmol/L組； 5.雷公藤多苷160 μmol/L組。 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖3雷公藤多苷對人口腔癌KB 細胞p-PI3K(A)和p-AKT(B)蛋白表達

4 討論

口腔癌是一種由于多種因素(生活方式、環境因素、遺傳因素等)共同作用所產生的一種惡性程度較高的腫瘤。關于口腔癌的發病機制目前尚未完成闡明，可能與人乳頭瘤病毒感染、不良生活習慣、抑癌基因失活等有關[10]。臨床上也無有效應對措施，因此探索皮膚癌的發生機制以及尋找有效治療藥物是目前亟待解決的問題。

增殖與分化異常是腫瘤細胞的兩個基本特征，其中抑制腫瘤細胞異常增殖是評價抗腫瘤藥物效果的一個較為直接的重要指標[11]。本研究發現雷公藤多苷對人口腔癌KB細胞的增殖具有明顯的抑制作用，且在一定劑量濃度范圍，隨著雷公藤多苷濃度的升高和處理時間的延長，對人口腔癌KB細胞增殖抑制率也隨之升高，呈濃度和時間依賴性。Bcl-2家族主要由抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax組成，它們也是線粒體凋亡途徑過程中最重要的調節因子[12]。Bcl-2主要通過減少線粒體細胞色素C的釋放而發揮抗凋亡作用，而Bax主要通過升高線粒體膜通透性和促進細胞色素C的釋放而起到誘導凋亡作用[13]。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵蛋白，可直接作為凋亡的效應分子，可引起細胞染色質凝集、DNA片段化，從而導致細胞的凋亡[14]。本研究發現雷公藤多苷可顯著降低人口腔癌KB細胞的Bcl-2 mRNA表達，而顯著升高BaxmRNA表達(P<0.05或P<0.01)，且呈濃度依賴性，提示了雷公藤多苷可能通過影響線粒體途徑，下調Bcl-2基因表達，上調Bax基因表達，從而激活Caspase-3的活性，最終引起細胞的凋亡。

近年來，作為細胞生存的重要通路，PI3K/AKT信號通路在促進增殖、促進血管生成、抵抗放化療、侵襲、抑制凋亡等方面受到了廣泛的關注[16]。多種惡性腫瘤中PI3K/AKT信號通路表達異常，如肺癌、卵巢癌和乳腺癌等[17]。PI3K是正常人體內一種磷脂激酶，由調節亞基(p85)和催化亞基(p110)組成，絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT是PI3K主要下游效應物。研究發現AKT在PI3K/AKT信號通路中已擁有100個以上的下游底物，其在調節細胞存活、增殖和凋亡中起著至關重要的作用[18]。近期研究表明p-AKT在口腔鱗狀細胞癌中過表達，提示p-AKT可能參與了口腔癌早期階段的發生發展[19]。本研究發現雷公藤多苷可以明顯降低人口腔癌KB細胞的p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平，且呈濃度依賴性。提示雷公藤多苷通過抑制PI3K/AKT信號通路，從而促進人口腔癌KB細胞的凋亡。

綜上所述，雷公藤多苷具有抑制人口腔癌KB細胞增殖和誘導凋亡作用，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路的激活有關。