腹水草水提液對(duì)胃潰瘍大鼠PGE2和COX-2表達(dá)的影響＊

張海霞 任偉銘 祁依佳 沈貴芳 趙偉春

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310053）

胃潰瘍是臨床上常見(jiàn)、多發(fā)性疾病。全球每年有1400多萬(wàn)人被診斷為胃潰瘍，約400萬(wàn)人死于相關(guān)并發(fā)癥。關(guān)于胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制，目前被廣泛接受的是攻擊因子和防御因子失衡學(xué)說(shuō)。胃潰瘍主要攻擊因子有胃酸，腫瘤壞死因數(shù)，內(nèi)皮素等。主要防御因子有NO及NO合成酶，前列腺素（PGs），表皮生長(zhǎng)因子等。PGs不在細(xì)胞中貯存，一旦機(jī)體需要，能很快通過(guò)環(huán)氧合酶（COX）反應(yīng)合成。COX-2誘導(dǎo)的直接結(jié)果是以前列腺素E（PGE）為主的PGs產(chǎn)物的合成增加，從而保護(hù)胃黏膜。PGE是最重要的胃黏膜保護(hù)因子之一，COX是PGs合成過(guò)程中重要的限速酶。在明確腹水草水提液抗大鼠乙醇型胃潰瘍的效果的基礎(chǔ)上，本文分析了腹水草水提液對(duì)PGE及COX-2的表達(dá)的影響，為明確腹水草對(duì)抗大鼠乙醇型胃潰瘍的作用途徑提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)SD大鼠48只，6～7周齡，體重180g～220g，雌雄各半，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。腹水草水提液的制備方法見(jiàn)沈貴芳等。RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒（批號(hào)：00064478）。PGE2試劑盒（批號(hào)：CKE90201R），上海源葉生物科技有限公司。COX-2兔抗鼠多抗（批號(hào)：BA0738），武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。β-Actin Antibody和Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（均購(gòu)自艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司生產(chǎn)。批號(hào)分別為：214673和214575）。

1.2 分組、給藥與造模

將48只大鼠按性別分層隨機(jī)化分成6組，每組8只。正常組和模型組灌胃生理鹽水（4mL/只）；雷尼替丁組灌胃0.18%雷尼替丁混懸液（0.027g/kg·d，0.0054g/只，臨床劑量的3倍）；腹水草各劑量組分別灌胃高、中、低劑量腹水草水提液(2.8、1.4、0.7g/kg·d，4mL/只)，1次/d，連續(xù)給藥14d。第14d給藥后1h，正常組灌胃1mL/只生理鹽水，其余大鼠均灌胃1mL/只無(wú)水乙醇造模，造模前禁食自由飲水24h。

表1 腹水草水提液對(duì)PGE2含量的影響（±s，n=8）

圖1 各組大鼠胃黏膜組織COX-2蛋白的Western Blot分析

圖2 名組大鼠胃黏膜組織COX-2//β-actin的蛋白比較

1.3 胃黏膜組織中PGE2的測(cè)定

取部分胃組織于0℃下勻漿，于4℃下20000r/min離心20min，取上清液。采用抗體夾心ELISA方法，測(cè)定胃黏膜組織中PGE的含量。

1.4 胃黏膜組織中COX-2蛋白的測(cè)定

采用RIPA裂解液提取胃黏膜組織蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western Blot分析。以COX-2/β-actin蛋白條帶的密度比值作為COX-2的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 胃黏膜組織中COX-2 mRNA的測(cè)定

采用Trizol試劑提取胃黏膜組織總RNA，經(jīng)非變性瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的完整性后按照RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。COX-2的PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸8min；β-actin的PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min；60℃退火45s；72℃延伸1min，25個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10min；PCR擴(kuò)增結(jié)束經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，以COX-2/β-actin比值表示各樣本mRNA的相對(duì)含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

圖3 各組大鼠胃黏膜組織COX-2 mRNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 各組大鼠胃黏膜組織COX-2/β-actin的mRNA比較

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃黏膜組織中PGE2含量的比較

結(jié)果見(jiàn)表1。模型組、雷尼替丁組和腹水草各劑量組大鼠胃黏膜組織PGE含量均顯著低于正常組（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。與模型組相比，腹水草各劑量組、雷尼替丁組的PGE含量均顯著提高（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。

2.2 各組大鼠胃黏膜組織中COX-2蛋白含量的比較

模型組、腹水草各劑量組和雷尼替丁組大鼠COX-2蛋白的表達(dá)量顯著高于正常組（圖1，圖2）。與模型組比較，腹水草各劑量組和雷尼替丁組大鼠的COX-2蛋白水平顯著增加（

P

＜0.01），其中腹水草高劑量組是模型組大鼠的3.9倍，是正常組大鼠的13.2倍。腹水草各劑量組大鼠的COX-2蛋白水平亦顯著高于雷尼替丁組。腹水草低、中、高劑量組間的COX-2蛋白水平亦隨著腹水草劑量的升高而提高（

P

＜0.01）。

2.3 各組大鼠胃黏膜組織中COX-2 mRNA的比較

正常組大鼠胃黏膜組織內(nèi)COX-2 mRNA的表達(dá)量最低，COX-2/β-actin為0.071±0.018（圖3，圖4）。腹水草各劑量組、雷尼替丁組和模型組COX-2 mRNA水平均顯著高于正常組，其中腹水草高劑量組是正常大鼠的11.4倍（

P

＜0.01）。雷尼替丁組、腹水草中劑量組和腹水草高劑量組的COX-2 mRNA的表達(dá)量高于模型組（

P

＜0.01）。腹水草各劑量組間COX-2 mRNA的表達(dá)量差異不顯著（

P

＞0.05）。

3 討論

PGE是最重要的胃黏膜保護(hù)因子之一，但其保護(hù)胃黏膜的機(jī)制尚未闡明。一般認(rèn)為，與其促進(jìn)黏液及HCO的分泌，改善細(xì)胞內(nèi)對(duì)H+的中和能力，增加表面疏水性、保護(hù)黏膜屏障、調(diào)節(jié)胃黏膜血流量等有關(guān)。已有研究表明，雙蒲散提高潰瘍愈合質(zhì)量的機(jī)制可能是增加胃黏膜組織PGE含量，促進(jìn)黏膜修復(fù)。酒速愈可通過(guò)升高胃黏膜PGE含量，加強(qiáng)胃黏膜的黏液—碳酸氫鹽屏障，減輕乙醇對(duì)胃黏膜的損傷。腹水草具有去腐生肌和散血逐瘀的作用，本實(shí)驗(yàn)表明，腹水草水提液通過(guò)促進(jìn)胃組織中PGE的合成及釋放來(lái)保護(hù)胃黏膜。

PGE在體內(nèi)由花生四烯酸(arachidonic acid，AA)所合成。細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶A的作用下生成花生四烯酸，花生四烯酸在環(huán)氧合酶的作用下生成環(huán)內(nèi)過(guò)氧化物前列腺素G(PGG)、前列腺素H(PGH)。PGH很不穩(wěn)定，很快轉(zhuǎn)變成前列腺素E(PGE)和血栓素A(TXA)等物質(zhì)。研究認(rèn)為，在正常大鼠胃黏膜組織中，COX-2蛋白幾乎無(wú)表達(dá)，COX-2 mRNA的表達(dá)量很少；但在胃潰瘍發(fā)生或潰瘍愈合的過(guò)程中，COX-2蛋白大量表達(dá)，COX-2 mRNA的表達(dá)量急劇上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，腹水草水提液能提高COX-2 mRNA和COX-2蛋白表達(dá)量，促使胃黏膜組織中PGE2含量增加，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃粘液及黏膜血流量，保護(hù)黏膜屏障，從而抑制胃潰瘍的發(fā)生。