激光剝蝕-電感耦合等離子體質譜分析缺鋅脅迫玉米根尖微量元素空間分布

張金堯，宋書會，郭 偉，徐芳森，汪 洪*

[1 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/農業農村部植物營養與肥料重點實驗室/農業農村部農產品質量安全肥料源性因子風險評估實驗室 (北京)，北京 100081；2 華中農業大學資源與環境學院，湖北武漢 430070]

鋅 (Zn) 是植物生長發育的必需營養元素[1]，缺鋅會導致植株節間縮短、葉綠素合成受阻、葉片脈間失綠或白化、發育推遲、籽粒瘦小等，進而造成減產[2-3]。營養元素在植物根系不同組織、細胞及亞細胞水平上分布不同[4]，這種空間信息對于揭示植物體內礦質元素穩態平衡與吸收轉運規律等具有重要意義。

近年來，應用能量色散X射線光譜和質子激發X熒光光譜等技術開展超積累植物體內重金屬元素積累成像研究[5-6]。激光剝蝕-電感耦合等離子體質譜法 (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry，LA-ICP-MS) 是將激光剝蝕進樣系統與電感耦合等離子體質譜儀聯用，通過激光剝蝕固體樣品生成氣溶膠后直接進入ICP-MS中進行元素含量測試，通過成像軟件實現固體樣品元素定位分布[7-8]。LA-ICP-MS因其易組裝、測定元素范圍廣 (涵蓋周期表中大部分元素)、所需樣品少 (只需幾微克)、空間分辨率高 (最小分辨率達2～5 μm)、靈敏度好等優點[7,9]，成為植物樣品中痕量元素分析的重要手段。利用LA-ICP-MS對玉米根系橫截面元素分布研究表明，汞離子不能橫跨根系內胚層障礙[10]。對兩個甘藍型油菜栽培品種根系與根際土壤磷 (P) 分布成像分析表明，土壤中P沿根軸向分布并于根尖擴散，且兩個油菜品種對P的吸收效率不同[11]。對小麥籽粒中錳(Mn)、銅(Cu)、Zn和P的空間分布分析結果顯示小麥籽粒中Mn、Cu、Zn和P在籽粒不同部位的含量分布差異很大。Cu、Zn和P含量以糊粉層最高，胚乳最低，胚居中；Mn在胚中較多，胚乳中分布較低，糊粉層居中。籽粒不同部位元素的含量變化存在明顯的同步性，說明不同元素在向籽粒不同部位運輸和積累過程中存在密切相關性[12]。Saatz等[13]利用LA-ICP-MS和飛行時間二次離子質譜 (ToF-SIMS)分析了稀土元素釓 (Gd) 和釔 (Y) 脅迫下玉米根系橫向薄層切片Gd和Y的細胞水平分布信息，發現在玉米根系表皮中具有高濃度Gd和Y斑點，而在皮層以內Gd和Y含量較低，相關稀土元素可能束縛于根表鐵膜。

本研究通過營養液培養玉米植株，利用LA-ICPMS技術，研究缺Zn脅迫下玉米根尖Fe、Mn、Cu、Zn元素的分布定位，以期從組織水平揭示作物中Zn的轉運富集規律及缺Zn對微量金屬元素吸收轉運的影響，為缺Zn影響玉米植株生長與生理代謝的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植株材料培養

以‘鄭單958’玉米作為試驗品種，取飽滿一致的玉米種子經10% H2O2浸泡消毒15 min，超純水洗3遍，浸泡24 h后，轉移到鋪有濕紗布的培養皿中，上蓋一層濕紗布，25℃黑暗中催芽1天。選擇發芽一致的種子放入洗凈的石英砂中，培養箱25℃育苗。一周后 (兩葉一心)，選擇長勢一致的幼苗，去掉胚乳，移栽到500 mL玻璃培養管中，每管1株，玻璃培養管直徑為5 cm，高20 cm，外用黑色布包裹避光，超純水 (超純水機，北京優普時代科技有限公司) 培養一天，然后進行營養液直接培養。幼苗培養在光照培養箱 (PRX-350D，寧波海曙賽福實驗儀器廠) 中進行，控制條件為光照時間12 h，光照強度18000 lx，白天溫度25℃、夜間20℃，相對濕度70%。

基礎營養液配方 (mol/L) 為：Ca(NO3)22.0 ×10-3；K2SO47.5 × 10-4；MgSO46.5 × 10-4；KH2PO42.5 ×10-4；EDTA-Fe (Ⅱ) 1.0 × 10-4；H3BO31.0 × 10-6；CuSO41.0 × 10-7；MnSO41.0 × 10-6；(NH4)6Mo7O24·4H2O 5.0 × 10-9。設置缺鋅和正常供鋅 (1 μmol/L) 兩個處理。鋅元素以ZnSO4形式供給，每個處理3次重復。營養液pH用NaOH或HCl調到6.0，每隔2天更換1次營養液。

培養15 d后采集根系，超純水浸泡清洗3遍，切取距離根頂端0.3 cm長的根段，貼于載玻片上，105℃殺青后烘干，固定于激光剝蝕系統 (LA) UP213(213nm Nd：YAG固體激光器，美國New Wave公司) 樣品臺上，進行LA-ICP-MS測定。

1.2 根系標準樣品制備

在6個不同鋅濃度 (0、0.1、1、10、50、100 μmol/L) 營養液直接培養玉米植株15天，采集植株根系，超純水浸泡清洗3遍，電熱鼓風干燥箱(BGZ140，上海博迅實業有限公司) 烘干，研磨儀(MM400，德國Retsch公司) 研磨成粉，混合均勻。取研磨后自制的根系粉末樣品及柑橘葉成分分析標準物質粉末各0.1 g (精確至0.0001 g)，加入6 mL優級純濃HNO3和2 mL H2O2，利用微波消解儀消煮，程序升溫為120℃ 5 min，160℃ 5 min，180℃ 15 min，消煮結束后利用超純水定容至50 mL，利用電感耦合等離子體質譜 (ICP-MS) (Agilent7700x，Agilent，USA) 測定待測液中 Zn、Fe、Mn、Cu 含量，得到自制根系標樣中元素含量。柑橘葉成分分析標準物質 (GSB-1，鋼研納克檢測技術有限公司)測定結果控制檢測過程準確度。利用LA-ICP-MS測定自制根系標樣信號強度與標樣中元素實際含量進行相關分析，得到標準曲線。

取50 mg研磨后的根系粉末樣品，利用壓片機(769YP-15A&24B，天津市科器高新技術公司) 壓成直徑為5 mm的薄圓片，置于激光剝蝕樣品池內，作為自制的根系標準樣品，將試驗玉米根尖樣品和標準樣品同時置于激光剝蝕池內，在同一試驗條件下利用LA-ICP-MS測定。利用上述標準曲線對玉米根尖樣品中元素含量進行定量分析。

1.3 LA-ICP-MS 儀器測定條件

LA系統采用Nd∶YAG激光器 (波長213 nm)，測定時聚焦激光束按行掃描根系樣品及標樣壓片，灼燒后的樣品物質由載氣Ar送入ICP，檢測66Zn、56Fe、63Cu、55Mn及13C的離子強度。LA-ICP-MS檢測參數見表1。

1.4 數據及圖像軟件分析

采用Excel 2010進行數據處理及相關統計分析，采用Sufer10.0進行元素分布圖像制作。

2 結果與分析

2.1 缺鋅脅迫下玉米根系微量金屬元素含量

缺鋅脅迫下玉米根系鋅元素含量顯著降低，僅為正常植株的27.78%；缺鋅根系中Mn和Cu含量升高，分別為加鋅處理的4.19倍和1.94倍，Fe含量差異不顯著 (表2)。

2.2 內標元素穩定性檢測

為了補償激光剝蝕進樣量不均勻對信號強度的影響，選擇13C作為內標元素，對各元素強度進行標準化處理。本試驗對6個自制標準壓片玉米根系樣品和柑橘葉成分分析標準物質樣品13C進行檢測，結果顯示，其信號波動相對標準偏差RSD值均低于10%，信號較為穩定 (圖1)。

表1 LA-ICP-MS檢測參數Table 1 Optimized experimental parameters of LA-ICP-MS

表2 缺鋅脅迫下根系微量金屬元素含量 (n = 6)Table 2 Trace element content in the root under Zn deficiency

圖1 根系自制樣品壓片標樣及柑橘葉內標13C信號穩定性Fig. 1 Signal stability of 13C in self-made root standard samples and citrus leaves[注（Note）：圖注中標樣1至標樣6分別代表經6個不同鋅濃度(0、0.1、1、10、50、100 μmol/L) 營養液培養獲得的根系自制樣品 The standard samples from 1 to 6 in the legend represent the selfmade samples of maize roots cultivated with of 6 different zinc concentrations solutions in 0, 0.1, 1, 10, 50 and 100 μmol/L,respectively.]

2.3 自制標樣標準曲線檢測

將自制玉米根系壓片樣品進行LA-ICP-MS測定，檢測信號值CPS (66Zn/13C)與樣品中實際Zn含量間呈良好的線性關系 (y = 0.018x + 0.0335，R2=0.9995)，從而得到LA-ICP-MS測定標準曲線 (圖2)。按此標準曲線，LA-ICP-MS測定柑橘葉GSB-11中Zn含量為17.80 mg/kg，與該標準物質的標準參考值(18 ± 2) mg/kg 相吻合。

2.4 缺 Zn 脅迫下玉米根系元素空間分布

圖2 自制根系壓片標準樣品LA-ICP-MS測定標準曲線Fig. 2 Standard curve of root samples measured using LA-ICP-MS

用LA-ICP-MS系統定量成像玉米根尖Zn的空間分布。玉米根尖頂端Zn含量分布較多，由表皮向內鋅含量逐漸增加，最高處在50 mg/kg以上 (圖3A-a)。相對于正常鋅培養條件，缺Zn處理根尖Zn含量降低，根尖頂端Zn分布明顯減少，普遍低于40 mg/kg(圖3B-a)。利用LA-ICP-MS檢測CPS信號強度值對Fe、Mn、Cu元素在根尖中的分布進行分析，發現在根尖前端信號強度較高，由表向內逐漸增加，與Zn分布類似；缺鋅處理下，根尖中Fe、Mn、Cu信號強度均有不同程度增加 (圖3-A、B)。

3 討論

LA-ICP-MS定量測定植物組織中的元素分布關鍵在于標準品的制備，在動物組織切片相關研究中，常將動物組織勻漿后加入標準液混勻作為標準物質，研究動物組織切片元素空間分布[7,9]。向植物干樣粉末中外源添加不同梯度濃度標準液，振蕩、烘干后壓片，制作標準樣品，進行LA-ICP-MS測定[7-8]，但此類標樣目標元素濃度均勻性較差，內標元素穩定性低，影響掃描結果。Huelga-Suarez等[14]利用標準溶液浸泡濾紙，以此作為標準樣品，但此方法中標樣和實際待測樣品基體性質不同，可能對測定產生影響。本實驗利用不同濃度含鋅營養液培養玉米植株，獲得根系樣品后，進行烘干、粉碎、混勻、壓片，將其分為兩份，一份利用硝酸消煮，ICP-MS測定，獲得樣品中實際Zn元素含量，制作適于LACP-MS測定的玉米根系標準樣品。將此標準樣品與待測根尖樣品放入LA樣品池中，13C作為內標元素，開展缺鋅脅迫下玉米根尖中鋅元素分布特征的定量成像研究，發現正常施鋅玉米根尖中鋅、鐵、錳、銅分布呈現出由表皮向中柱增加的趨勢。

圖3 正常 (A) 及缺鋅脅迫下 (B) 根尖微量金屬元素分布Fig. 3 Distribution of microelements in root tips under normal (A) and zinc deficiency (B) conditions[注（Note）：a—Zn含量分布Zn content distribution；b—Fe CPS比分布Fe CPS ratio distribution；c—Mn CPS比分布Mn CPS ratio distribution；d—Cu CPS比分布Cu CPS ratio distribution；左側箭頭方向代表根尖頂端 The direction of the left arrow represents the apex of the root tip.]

研究生物樣品中元素分布技術還有質子激發X射線分析 (PIXE)[15]、同步輻射X射線熒光 (SRXRF)[16]、二次電離質譜 (SIMS)[17]、基質輔助激光解吸附質譜 (MALDI-MS)[18]等，相比而言，LA-ICPMS通過激光剝蝕對固體樣品表面原位采樣，提供直觀的固體表面空間分辨信息，具有多元素測定、高靈敏度、寬數量級、樣品制備需樣量少、易操作、定量分析簡潔以及可進行同位素分析等優點[19]。但是LA-ICP-MS技術目前在植物學研究上還存在一些不足：缺少與植物樣品基質相近的標準物質；分析過程中存在著激光與樣品相互作用、樣品氣溶膠傳輸及氣溶膠顆粒在ICP中離解時產生的分餾效應影響元素定量分析；雙電荷和多原子離子產生的基質效應會干擾某些元素的測定，影響定量測定結果[19]。更加精細的樣品室的設計、進樣方式的改進、飛秒級激光的應用，可以提升在微米級更小尺度上植物元素定量分布成像精度與檢出限。

本文利用LA-ICP-MS成像結果表明，缺鋅脅迫下玉米根尖鋅含量顯著降低，鐵、錳、銅不同程度積累。缺Zn脅迫下，植物Fe轉運蛋白編碼基因IRT1、ZIP4表達上調，擬南芥等植物對Fe的吸收運輸增多[20-21]。植物體內金屬忍耐家族蛋白 (MTP蛋白)和自然抗性相關巨噬家族蛋白 (NRAMP蛋白) 可同時轉運Zn和Mn，缺Zn時上述兩類蛋白上調表達，可能是缺鋅導致根系Mn含量增加的原因[22]。煙酰胺轉運蛋白 (NA蛋白) 是Zn、Cu及Fe的胞間和長距離運輸蛋白，多數研究者認為缺Zn時NA蛋白的表達上調，可能會促進Cu在缺鋅植物體內積累[23-24]。

4 結論

本研究利用不同濃度加鋅營養液培養玉米植株獲得了可適用于LA-ICP-MS定量分析的自制根系標準樣品，以13C作為內標元素進行缺鋅脅迫下玉米根尖鋅元素分布特征的定量成像及鐵、錳、銅微量金屬元素的定性成像研究。成像結果顯示，正常施鋅玉米根尖中鋅、鐵、錳、銅分布呈現出由表皮向中柱增加的趨勢；缺鋅脅迫下根尖鋅含量顯著降低，鐵、錳、銅不同程度積累。本研究表明，LA-ICPMS可在植物營養機理研究中發揮重要作用。