蛋白質精氨酸甲基化轉移酶與哺乳動物生殖

王藝琛，高輝，張昌軍，刁紅錄

(1.十堰市人民醫院(湖北醫藥學院附屬人民醫院)生殖醫學中心，十堰 442000；2.湖北醫藥學院生物醫藥研究院，十堰 442000；3.湖北醫藥學院生物醫學工程學院，十堰 442000)

哺乳動物生殖系統中的調控網絡復雜而精確，任何一個環節都不容忽視。組蛋白翻譯后修飾在其中有著必不可少的作用。蛋白質精氨酸甲基化是表觀遺傳水平重要的修飾方式之一，它參與了配子發生、性激素調控、胚胎發育以及生殖系統疾病發生發展等活動。本文對精氨酸甲基化修飾活動進行了簡單的總結，旨在對研究者們提供一定參考。

一、PRMTs概述

翻譯后修飾(PTM)是表觀遺傳學中的核心部分，而組蛋白甲基化在其中有著重要的作用，其中決定組蛋白甲基化位點的蛋白質精氨酸甲基轉移酶(Protein arginine methyltransferases，PRMTs)已被證明在人體的各個組織中廣泛分布。PRMTs在前體RNA的剪切、細胞信號轉導、DNA的修復、mRNA的翻譯以及細胞分化過程中有重要作用[1]。PRMTs作為一類甲基化酶，它可以催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyme-thionine，SAM)上的甲基轉移到精氨酸的胍基上，并產生甲基精氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸。已有研究證明，哺乳動物體內有三種PRMTs存在，分別為Type Ⅰ(PRMT1、PRMT2、PRMT3、PRMT4/CARM1、PRMT6 和 PRMT8)，Type Ⅱ(PRMT5 和 PRMT9)以及Type Ⅲ(PRMT7)[2]。Ⅰ型和Ⅱ型可以分別催化中間產物MMA生成非對稱二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine，aDMA)和對稱二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine，sDMA)，而Ⅲ型只能催化組蛋白生成單甲基精氨酸(Monomethylarginine，MMA)(圖1)[1]。MMA，aDMA與sDMA是哺乳動物體內存在的三種主要甲基精氨酸形式[1，3]。

圖1 蛋白質精氨酸甲基化轉移酶作用底物及產物[1]

目前已知PRMTs可以甲基化的具有研究意義的位點有H3R2、H3R8、H3R17、H3R26和H4R3，這些位點具有激活或抑制染色質功能的作用[2]。PRMTs家族中所有成員都含有大約310個保守的氨基酸核心催化區域，有一些成員還含有特殊的結構，如含有SH3結構的PRMT2，含有鋅指結構的PRMT3，含有TIM barrel結構的PRMT5以及含有重復TPR結構的PRMT9。值得一提的是，PRMT7和PRMT9都含有兩個重復且連續的甲基轉移酶片段，而其它成員只有一個催化中心，這可能是因為基因自主復制的原因[3]。Tudor結構域是一個保守的含有50個氨基酸的多肽，甲基化后的精氨酸與其結合的能力增強了，目前已知的主要可以被甲基化的含有Tudor結構域的多肽有活性運動神經元(Survival of motor neuron，SMN)，剪切因子(Splicing factor 30，SPF30)以及Tudor domain-containg protein1/2/3/6/9/11(TDRD1/2/3/6/9/11)[4]。

二、PRMTs在生殖中的功能

1.PRMTs與配子發生：配子形成的過程稱為配子發生。配子包括雄配子和雌配子，雌、雄配子的發生都要經過三個時期，即增殖期、生長期和減數分裂期。原始生殖細胞(Primordial Germ Cell，PGC)是指產生雄性和雌性生殖細胞的早期細胞。PRMT5與生殖細胞決定基因(PR domain zinc finger protein 1，PRDM1)共同促進PGC的發生發育，通過促進Sm剪接體蛋白(a family of RNA-binding proteins)的甲基化并顯著改變PGC的RNA剪接譜來調節基因表達。小鼠胚胎發育到第8.5天時，PRMT5在細胞中的表達從細胞質轉移到細胞核，能夠導致高水平的H4R3me2修飾。在精、卵結合后10.5 d，PRMT5通過抑制PGC的轉座因子和調控RNA的正確剪切來應對DNA損傷，從而起到保護基因組完整性的作用，這兩種依賴于PRMT5的保護機制能維持PGC的正常發生[5]。而在E11.5，PRMT5-BLIMP1復合物易位回到細胞質，隨后H4R3me2修飾減少，此時DNA甲基化在PGC中達到基礎水平。H4R3me2是一種抑制性組蛋白修飾，其中包括RNA剪接和p53所必需的神經祖細胞中的Sm蛋白。PRMT5催化的H2A/H4R3me2s修飾在早期PGC的LINE1長分散核元件1(Long interspersed nuclear element 1，LINE1)和凋亡抑制因子(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)轉座子上大量發生，PRMT5的失活會導致這種修飾減少，PGCs的凋亡，以及雄性和雌性不育[6]。精子的成熟要經歷精原細胞、初級次級精母細胞以及精子細胞階段，精氨酸甲基化在其中也扮演著重要的角色。 PRMT5主要在雄性小鼠睪丸的精母細胞中大量表達，而不是精子發生過程中的其他階段。PRMT5敲除后，小鼠的初級精母、初級卵母細胞不能正常的進行減數分裂，二甲基化H4R3變少，而且其增殖也會變得異常。這說明PRMT5在生殖細胞發育中的功能可能是由H4R3me2介導的[7-8]。PRTM4在小鼠睪丸中高度表達。在精子發生過程中，PRMT4首先表達在精母細胞的胞質，而后表達在精子細胞的細胞核，這表明PRTM4主要在精子發生后期具有重要作用[9]。PRMT6作為剪切和修復DNA堿基的調節因子，可通過與DNA聚合酶形成復合物來刺激DNA聚合酶的活性。DNA堿基的切除修復在初級精母細胞和圓形精子細胞的發生過程中有著重要作用，而DNA聚合酶也被發現在減數分裂中參與染色體結合和重組過程。表明PRMT6可通過調節DNA聚合酶在減數分裂和重組中發揮作用從而影響精子的發生[10]。

2.PRMTs與受精：受精是卵母細胞和精子融合為一個合子的過程，受精過程包括卵母細胞激活、精子獲能和兩性原核融合三個主要階段。當精子進入卵母細胞時，它必須經歷依賴于母體因素以進行生化重塑。

精子頭部的去致密化是由母核纖溶酶2(Nucleoplasmin 2，NPM2)進行的，它將魚精蛋白釋放到卵母細胞的細胞質中，為雄原核(pronuclei，PN)的形成做好準備。原核新核小體的組裝依賴于母體組蛋白H3.3及其伴侶蛋白Hira(Histone cell cycle regulator，Hira)，這對于PN的形成至關重要。缺乏非對稱二甲基化組蛋白H3R17me2a的H3.3不能參與PN的形成，說明Ⅰ型PRMTs對稱二甲基化H3R17me2a修飾在受精早期可能起著重要的作用[11]。

3.PRMTs與早期胚胎發育：早期胚胎正常發育是維持妊娠的重要環節，包括受精后早期的細胞分裂，桑葚胚、囊胚的形成及胚泡植入子宮內膜等過程。任何影響早期胚胎發育的因素都可能導致胚胎發育缺陷。

胚胎干細胞對胚胎各個系統的正常發育是至關重要的。PRMT1能夠甲基化富含甘氨酸-精氨酸的結構域，抑制小鼠胚胎成纖維細胞中PRMT1的表達會導致此類型結構域的低甲基化(如Sam68和MRE11等)，致使自發性DNA損傷，進而發生細胞周期進程延遲，染色體非整倍性和多倍體的出現，最終胚胎在E6.5死亡[12]。抑制PRMT1在神經系統中的表達，會導致小鼠出現了嚴重的神經性震顫并且在出生后兩周內死亡。PRMT1缺陷小鼠神經系統內成熟少突膠質細胞大量減少，說明PRMT1可能對少突膠質細胞的成熟起著重要作用[13]。PRMT1小鼠血管內皮細胞特異性敲除小鼠在出生后15 d內死亡，主要原因是胚胎表面顳動脈血液灌注不良，3D成像顯示血管分段且擴張成空腔[14]。PRMT3的缺失會導致胚胎在妊娠期間發育遲緩，主要原因是小鼠成纖維細胞胞質中核糖體蛋白rpS2(40S ribosomal protein S2，rpS2)的低甲基化[15]。PRMT4敲除小鼠在出生后不久死亡，可能是其胸腺細胞的發育停留在祖細胞階段，而脂肪細胞的生成也有障礙，其體型較野生型小。PRMT4/ CARM1在早期神經元發育中也有重要作用，Sox1和NF1分別是參與維持早期神經元祖細胞和星形膠質細胞系平衡的基因，CARM1可以通過甲基化H3R17來調節Sox1和NF1的轉錄。此甲基化過程在發育后期對膠質譜系特異的miRNA啟動子如miR10a、miR575和miR92a發揮進一步的調節作用[16]。CARM1可以調節卵裂球中組蛋白H3R17和H3R26的甲基化水平，這兩種組蛋白的甲基化會促進小鼠植入前胚胎內細胞團的發生，這是表觀遺傳控制胚胎干細胞多能性所必需的[17]。在神經干細胞中選擇性敲除PRMT5 同樣會導致小鼠在出生后不久死亡，主要原因是PRMT5的缺失會導致Sm蛋白甲基化水平下降并且Mdm4(p53 regulator)前體RNA的合成異常會激活p53信號通路，從而引起細胞程序性死亡[18]。PRMT6敲除小鼠可以正常存活，但分離出來的胚胎成纖維細胞在體外卻發生早衰，這可能是因為PRMT6缺失致使胚胎成纖維細胞在體外細胞周期停留在G0/G1期[19]。PRMT8是一種特異性表達在神經系統內的精氨酸甲基化修飾酶。它的缺失會擾亂了軸突或樹突在發育中所需蛋白質的合成，這對視覺皮質回路的形成造成了不利影響從而使視覺下降或消失[20]。

圍著床期信號調控網絡精確，分子動態變化復雜，精氨酸甲基化活動也參與在其中。缺乏PRMT4胚胎細胞雌激素受體蛋白和NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)信號傳導途徑存在缺陷，并且雌激素應答的消除和一些ERα靶基因的表達也減少[21]。 受精卵中的PRMT5是母系遺傳的，且PRMT5蛋白的表達在4到8細胞期之間被激活。在原始生殖細胞中，PRMT5蛋白在胚胎發育的4細胞階段以及E8.5從細胞質轉移至細胞核中。在胚胎植入后，PRMT5蛋白重新從細胞核轉出至細胞質，主要在外胚層細胞中表達。這時的外胚層細胞屬于相對休眠狀態的滋養外胚層，PRMT5則啟動DNA甲基化和RNA剪切活動[6， 22]。PRMT5在著床前后由細胞質轉移至細胞核，并介導組蛋白甲基化活動，說明它在著床過程中可能起到了一定的作用。PRMT5敲除小鼠在E6.5停止發育，這可能是由于其囊胚期多能干細胞多能性的喪失而導致。進一步研究表明在PRMT5缺陷胚胎生殖細胞中H4R3me2s顯著降低，而H3R2me2s的水平不變說明PRMT5可能通過調節H4R3me2s水平調節生殖細胞發育[23]。

敲除模型是研究早期胚胎發育的一個重要技術，PRMTs家族成員的敲除模型證明PRMTs無論是對組蛋白修飾、信號轉導還是細胞周期都是必不可少的。因此，深入研究PRMTs影響發育的機制對生殖領域具有重要意義。

4.PRMTs與性激素受體：性激素調控在哺乳動物生殖中有著重要作用。性激素受體包括雄激素受體(AR)、雌激素受體(ESR)和孕激素受體(PGR)，性激素是經其受體通過上下級聯信號傳導而發揮生物學作用，所以性激素受體的正常表達對生殖系統中存在的信號轉導有著重要的作用。雌激素的生物學作用是通過受體ESRα和ESRβ介導的，ESRα和ESRβ在細胞核中起著配體依賴型轉錄因子的作用。ESRα的甲基化是動態的和周期性的，在雌二醇(E2)處理過的細胞中，PRMT1可以瞬時甲基化ESRα內的精氨酸260(R260)DNA結合域。雌二醇可以通過控制ESRα，酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)和PI-3激酶的p85亞基(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)的復合物來快速激活雌激素受體細胞質途徑，傳導信號至下游使激酶MAPK和AKT活化來協調細胞增殖和存活。被甲基化后的ESRα可用于控制雌激素的快速生理反應，誘導復合物的解離并最終導致下游激酶活性的消失[24]。PRMT1的結合蛋白FOP在激活雌激素受體靶基因(Trefoil factor 1，TFF1)中起重要作用，FOP的敲除會導致雌激素受體的啟動子被阻斷。因此猜測FOP募集到啟動子是激活雌二醇依賴性轉錄的關鍵蛋白[25]。PRMT2可增強雌激素受體ESRα、雄激素受體AR、孕激素受體PGR 、視黃酸核受體(retinoic acid receptor alpha，RARα)、過氧化物酶增殖激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的轉錄活性[26]。外源性雌激素也可以阻斷PRMTs的甲基化活動，如他莫昔芬(Tamoxifen，Tam)可以抑制CARM1作為共激活因子的作用從而抑制雌激素受體的的活化[24， 27]。此外，雌激素ESRα受體的共激活因子的募集是有序的，ESR招募類固醇受體輔助激活因子3(steroid receptor coactivator-3，SRC-3)，和共激活因子p300/CBP與CARM1。CARM1的招募滯后于SRC-3和p300。CARM1的募集改變了已有的ERE/ESRα/SRC-3/p300復合物的結構組織。它誘導p300發生構象變化，增加其對組蛋白H3K18殘基上p300的乙酰化，從而使H3R17殘基甲基化以增強自身的轉錄活性[9， 28]。

AR是核受體(Nuclear receptor，NR)超家族的成員，在配體結合后轉位進入細胞核并與DNA應答元件相互作用以調節靶基因轉錄。PRMT2的兩末端在與AR結合的過程中分工不同，C末端負責與AR結合，而N-末端則負責轉錄的共激活[29]。AR的轉錄激活需要PRMT6的催化活性和AKT結構域精氨酸殘基的甲基化參與。而PRMT6可以促進前列腺癌特異性抗原PSA(Prostate-specific antigen，PSA)和KLK2(kallikrein-2，KLK2)的轉錄，提示PRMT6可能通過調控AR下游靶基因的轉錄，從而促進前列腺癌的發生發展[30]。

5.PRMTs與不孕相關疾病：多囊卵巢綜合征(PCOS)是生育期女性常見的女性內分泌紊亂和糖脂代謝異常的全身性疾病，是女性不孕主要原因之一。最近的一項研究表明，PCOS婦女血液循環中的aDMA濃度明顯高于對照組，但提高血清雌、孕激素可以降低aDMA的濃度，并且可以降低胰島素抵抗[31-32]。aDMA作為一氧化氮合酶(NO synthase，NOS)的內源性競爭性抑制劑可抑制NO 的合成，使NO/NOS 通路發生障礙、NO 合成減少。PRMT1、PRMT2和PRMT4的過表達會導致aDMA的合成大量增加，aDMA的積累會影響NOS和NO的合成，而過低的NO濃度會提高PCOS發生的機率[33]。

子宮內膜異位癥是指有活性的內膜細胞種植在子宮內膜以外的位置而形成的一種女性常見婦科疾病，它是一種慢性疾病，異位的內膜造成不育和慢性疼痛。免疫組織化學證實CARM1蛋白在子宮內膜和卵巢中的表達下調，并根據月經周期表現出動態表達模式，在增生晚期和分泌中期表達較高，在分泌晚期表達較少[34]。在子宮內膜異位癥發生15個月后，卵巢中PRMT1、PRMT2和PRMT8以及CARM1蛋白顯著降低，提示精氨酸甲基轉移酶的失調可能會導致良性和癌前疾病的發生，如細胞增殖減弱、異常細胞克隆和基因組不穩定等變化。而且，顆粒細胞和排卵前卵母細胞中CARM1的轉錄和蛋白質水平也顯著降低[35]。

三、展望

雖然人們對精氨酸甲基化酶的結構和生化特性有了較深入的認識，但是對這些酶的生物學功能和其參與的調控網絡還知之甚少，尤其是動物中精氨酸甲基轉移酶的生物學功能以及其調控的生物學過程的分子機理還不清楚。基因的功能和生物學過程的進行是由染色質的狀態決定的，組蛋白翻譯后修飾在調節真核生物染色質的功能狀態中起關鍵的作用。已有的結果證明精氨酸甲基轉移酶可以甲基化組蛋白精氨酸位點。因此，對參與催化組蛋白翻譯后修飾和隨后的細胞表觀遺傳狀態的精氨酸甲基轉移酶的功能分子機制進行深入研究和解析將有助于人們進一步了解生物生長發育的調控和如何適應環境的。精氨酸甲基化轉移酶在生殖系統中的功能，以及對生殖系統疾病發生發展的分子機制還需我們花費更多的努力及時間來探尋。