宜昌市一種核桃黑斑病病原菌的分離及鑒定

王鵬程　吳楚　孫智　彭新　韓永世　孫長城　賈切

摘要：為明確引起宜昌市核桃黑斑病的病原菌，根據柯赫氏法則測定其致病性，通過形態學觀察和rDNA-ITS序列分析鑒定病原菌。結果表明，引起宜昌市核桃黑斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢

（Alternaria alternata）。

關鍵詞：核桃黑斑病;分離鑒定;形態學觀察;鏈格孢（Alternaria alternata）;宜昌市

中圖分類號：S436.64 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）18-0055-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.013 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation and identification of a pathogen of walnut black spot in Yichang city

WANG Peng-cheng1，WU Chu2，SUN Zhi1，PENG Xin3，HAN Yong-shi4，SUN Chang-cheng5，JIA Qie2

（1.Hubei Three Gorges Polytechnic， Yichang 443000，Hubei，China;2.College of Horticulture and Gardening，Yangtze University，Jingzhou 434000，Hubei，China;3.Guojiaba Town Forestry Station of Zigui County，Zigui 443621，Hubei，China;4.Zigui County Forestry Bureau，Zigui 443600，Hubei，China;5.Xiakou Town Agricultural Technology Service Center of Xingshan County，Xingshan 443701，Hubei，China）

Abstract： To identify the pathogen causing walnut black spot in Yichang city， the pathogenicity was determined according to Koch's rule. And the pathogenic bacteria was identified by morphological characteristics and rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that Alternaria altenata was the pathogen causing walnut black spot in Yichang city.

Key words： walnut black spot; isolation and identification; morphological observation; Alternaria alternata; Yichang city

核桃黑斑病是一種世界性病害[1]，對該病害的研究報道較多[2-6]，普遍認為黑斑病具有潛伏期長、發病時間短、暴發性強等特點;主要為害葉片、嫩枝、幼果及花序。當為害葉片時，先在葉片上出現圓形或者不規則小褐斑，隨著病情發展，病斑相連成片，最后葉片脫落;為害嫩枝時，在嫩枝上形成黑褐色長條形斑，稍凹陷，最終病斑擴展包圍枝條而使上段枯死;花序感病后產生黑褐色水漬狀病斑，造成落花;果實受害后果面上形成黑褐色小點，隨著病情發展，病斑不斷擴大并逐漸下陷、變黑，果實腐爛脫落;未脫落的受害果實干癟皺縮，核殼、核仁變黑，失去食用價值。

目前宜昌市有近4.6×105 hm2核桃樹[7]，當地林業部門把核桃生產作為頭等大事來抓。2018年春在秭歸縣進行果樹病害調查時發現核桃樹上有疑似核桃黑斑病病害，初步統計病株率高達30%以上，且呈暴發之勢。據當地果農反映，這種病害每年都會發生，且很嚴重，常規施藥防治效果不理想，嚴重影響了當地核桃生產和果農的積極性。為有效控制和防治該病害蔓延，對病原進行了分離、致病性測定和rDNA-ITS鑒定，初步確定了該病原菌分類定位，期望為探索該病害的防治措施提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?樣品采集 ?2018年5月分別從宜昌市秭歸縣郭家壩鎮白云山村及煙燈堡村核桃種植基地采集具有典型黑斑病癥狀的當年生幼嫩枝條，分別放于自封生物標本袋中帶回實驗室，直接分離病原菌或置于冰箱冷藏保存。采集健康核桃葉片及幼嫩枝條用于回接試驗，進行致病性檢測。

1.1.2 ?試驗試劑、儀器與設備 ?Taq DNA聚合酶、緩沖液體系均由TaKaRa公司提供，定制引物、基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均由上海Sangon公司提供。

普通光學顯微鏡，E100，日本Nikon公司;PCR儀，9700型，美國ABI公司;DNA測序儀，3730XL型，美國ABI公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌株分離純化 ?參照方中達[8]的方法，將幼嫩枝條沖洗干凈，自然風干，用消毒剪刀切取病健交界處約4.0 mm×4.0 mm的組織，放于75%乙醇中消毒10～15 s，再經2% NaClO表面消毒4 min，然后用無菌水漂洗3次，最后轉至PDA平板上，置于25 ℃恒溫連續光照條件下培養3～4 d，待菌落長出后，挑取菌落邊緣形態比較單一的小塊菌絲轉接到新的PDA平板上培養，重復純化2～3次后挑取形態比較單一的小塊菌絲移至PDA斜面試管中，于25 ℃恒溫連續光照培養4 d后置于4 ℃冰箱內貯存備用。

分離菌株的單孢純化采用分生孢子稀釋法。供試菌株在PDA培養基中25 ℃連續黑暗培養7 d，加無菌水2 mL，用滅菌棉簽輕洗培養菌落，配制分生孢子懸浮液，然后用無菌水進行梯度稀釋，直至普通光學顯微鏡10×40放大倍率視野中鏡檢到1～2個分生孢子為止;最后將孢子懸浮液均勻涂抹在PDA培養基平板上。2 d后，再挑取單個分生孢子萌發產生的單菌落，移至PDA斜面培養保存備用。

1.2.2 ?致病性試驗 ?按照柯赫氏法則，選取新鮮且健康的核桃葉片和幼莖莖段，用75%乙醇表面消毒后再用無菌水沖洗2～3次，放入鋪有濕潤滅菌吸水紙的搪瓷盤中，擺放整齊。用直徑5.0 mm的打孔器在PDA平板上活化培養5 d的菌落邊緣打孔，然后將菌絲塊接種到葉片上，用保鮮膜封盤，置于25 ℃恒溫、12 h光暗交替條件下保濕培養，設置3次重復，PDA作為空白對照。接種2 d后移去菌絲塊，連續10 d觀察發病情況并進行記錄。若癥狀相同，則對發病組織進行再分離，分離得到與原始接種菌株培養特征一致的菌株則可確定為該病的病原菌。

1.3 ?病原菌形態鑒定

1.3.1 ?菌落培養性狀觀察 ?將直徑5.0 mm的菌絲塊接種到PDA平板上，在25 ℃恒溫連續光照條件下培養，觀察記錄病原菌的菌落特征以及有無分生孢子產生。

1.3.2 ?產孢表型觀察 ?參照張天宇[9]的方法，取濾紙剪成比載玻片小的長方形，將中心挖1 cm左右的小方孔，滅菌后用無菌水潤濕放于無菌載玻片上。然后從活化5 d的菌落邊緣挑取小塊菌絲均勻涂于濾紙中央方孔邊緣，再將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的滅菌培養皿中，25 ℃恒溫連續光照條件下培養2 d后取出載玻片，在光學顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗形態。

1.4 ?菌株rDNA-ITS分子鑒定

1.4.1 ?DNA提取和引物擴增 ?取無菌的玻璃紙平鋪在凝固的PDA培養基表面。從活化5 d的菌落邊緣打取直徑6.0 mm菌絲塊，置于玻璃紙上。25 ℃恒溫光照條件下培養，5 d后收集菌落邊緣新鮮菌絲。

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取DNA。取6 μL DNA瓊脂糖凝膠液電泳檢測，用英國Syngene G：BOX EF 2凝膠成像系統進行拍照。

采用真菌生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4對rDNA-ITS區域進行PCR擴增。

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

1.4.2 ?PCR反應體系與ITS序列分析 ?PCR反應體系總體積為50 μL，反應液組分為：10×PCR Buffer（含MgCl2）5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1和ITS4（25 μmol/L）各1 μL，加ddH2O使總體積達到50 μL，在PTC-100 PCR擴增儀上擴增。擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應結束后取6 μL產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物委托深圳華大基因科技有限公司進行DNA純化和測序。測序結構登錄NCBI進行Blast比對。

2 ?結果與分析

2.1 ?病原菌菌落形態

將所采病樣經過3次單菌落分離和純化，獲得1株真菌，編號為JF1。初期菌落生長較慢，菌絲絨毛狀，白色，菌落近圓形，較整齊，隨著菌落不斷擴大，菌落顏色逐漸呈淺灰色或深灰色;氣生菌絲致密厚實，無異味。翻轉培養基觀察，背面灰黑色至黑色，呈同心輪紋狀（圖1）。

2.2 ?菌種形態觀察

取出載玻片在光學顯微鏡下觀察，JF1菌絲單生或有分枝，有隔，有鎖狀聯合。分生孢子梗鏈短、分枝較多，直立或彎曲;分生孢子黃褐色，倒棒狀、倒梨形或橢圓形，臍部明顯，具有若干橫、縱隔膜，分隔處平滑或縊縮，頂部有鳥嘴狀突起的喙，初步判斷為鏈格孢屬真菌（圖2）。

2.3 ?菌株致病性確定

取菌絲塊分別接種到活體核桃葉片和幼莖上，3 d后該菌在核桃莖干（圖3a）和葉片（圖3b）上開始出現病斑，繼續培養，病斑不斷擴大（圖3b、圖3c），持續觀察10 d并記錄癥狀變化情況，發現此癥狀與之前采樣的核桃病癥一致（圖3）。

2.4 ?菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測

按試劑盒操作說明及相關方法從菌體中提取出基因組DNA，提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA條帶清晰、較明亮，可以作為PCR反應的模板;以DNA為模板，ITS1、ITS4為引物，對rDNA-ITS區段PCR擴增，擴增片段大小約為562 bp。

2.5 ?rDNA-ITS序列分析

ITS序列長度為562 bp，提交GenBank數據庫進行Blast比對，登錄號為MF785102.1、JF439442.1、MH619630.1。其中，MF785102.1（Alternaria alternata）相似度達100%。進一步結合MEGA 7.0分子軟件，以5種鏈格孢屬種即鏈格孢（Alternaria alternata）、蘆薈黑斑病菌（Alternaria aborescens）、空心蓮子草黑斑病菌（Alternaria alternantherae）、人參黑斑病菌（Alternaria panax）和向日葵黑斑病菌（Alternaria helianthi）在GenBank已知的ITS序列為參照，采用鄰接法構建系統發育樹（圖4）。結果表明，JF1菌株與4株Alternaria alternata（HQ257255、GU566303、GQ249171和AB470838）聚為一支，相似度為86%，鏈格孢屬其他菌株所在分支按相似度不同與其并列。結合形態學特征，將其鑒定為Alternaria alternata。

3 ?討論

鏈格孢屬真菌是世界性分布的真菌，包括腐生、內生和致病性等種類[10]。據報道，95%以上的鏈格孢種類兼性寄生于植物上，代謝產物即毒素可導致受害植物產生各種癥狀，如黑斑病、褐斑病、莖枯病、赤星病等，嚴重影響作物的產量和品質，給農業生產帶來巨大損失[11]。自從2002年Belisario等[12]在核桃樹的病斑上分離到鏈格孢屬真菌后，鏈格孢對核桃的危害開始引起人們關注;Hong等[13]認為有3種鏈格孢可侵染核桃，分別是鏈格孢、細極鏈格孢和樹狀鏈格孢;在致病過程方面，Moragrega等[14]認為鏈格孢屬真菌既能夠單獨致病，又可與其他病原生物共同致病;曲文文等[15，16]在山東省也從核桃病斑中分離出了鏈格孢屬真菌，認為鏈格孢是造成核桃黑斑病和頂端褐色壞死的主要病原菌。本試驗在宜昌市也分離到鏈格孢屬真菌，認為鏈格孢屬真菌是造成宜昌市地區核桃黑斑病的主要病原菌之一。

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