貴州油茶炭疽病Colletotrichum fioriniae病原鑒定研究

秦紹釗，洪之國，王建偉

（1.凱里學院；2.黔東南州農產品質量安全檢測中心，貴州凱里 556011）

油茶（Camellia oleifera Abel），是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），油茶是世界四大木本食用油料植物之一[1]，為貴州地區的鄉土樹種，栽培歷史悠久，種植區廣泛，主要分布在黔東南州、銅仁市、黔西南州、畢節市等地區，山區群眾具有豐富的油茶種植經驗。截至2018年種植面積達263.4萬畝，隨著油茶種植面積的擴大和良種使用率的提高，貴州油茶的病害問題日趨嚴重。油茶炭疽病主要危害油茶的葉、果實及枝梢，造成重大的經濟損失[2]。

油茶炭疽病發病的區域經田間調查觀察，結合前期研究和的報道[3,4]。熊朝偉等，2019報道玉屏油茶炭疽病為Colletotrichum camelliae[5]。本研究所鑒定的油茶炭疽病松針刺盤孢菌（Colletotrichum fioriniae）在貴州油茶病害研究中未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

2015-2018年采集病葉片于黔東南州天柱縣、錦屏縣及黃平縣；銅仁市玉屏縣、江口縣及松桃縣，分別集中于在6-7月，10-11月采集病樣，典型病征（如圖1-1）。病斑多為梯半圓形、不規則形，多為半葉型；病斑顏色為黃褐色，病斑部位薄且脆，密生小黑點或凸起，4℃保藏帶回實驗室進行病原菌分離試驗。

圖1-1 油茶炭疽病病葉

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化

常規組織分離法：先用75%的酒精處理病健交界的組織，0.1%升汞溶液消毒，無菌水漂洗干凈，PDA培養基純化培養，置于4℃下保存備用。

1.2.2 病原菌的形態鑒定

取5mm菌餅，在PDA平板26-28℃黑暗16h培養，2-5d連續觀察菌落的形態、顏色。取10μL分生孢子懸浮液在光學顯微鏡下觀察記錄其大小及形態特征。

1.2.3 分子鑒定與系統發育分析

取20 mg菌絲經液氮研磨，樣品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒，Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒SK8259。擴增引物如下：GpF：5’ATGTGCA AGGCCGGTTTCGC3’，GpR 5’TACGAGTCCTTCTGGCCC AT3’；ACTF5’GCCGTCAACGA CCCCTTCATTGA 3’，ACTR5’GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT3’。

將測序rDNA-ACT和rDNA-GADPH序列與GenBank中下載的相關參考序列分別用ClustalX1.83軟件進行比對分析。在多基因系統發育分析結果中選出與各分離菌株相似度較高的相應序列，將所選序列與Gen-Bank中炭疽菌相應基因序列采用MEGA7.0.14軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）做聚類分析，堿基序列間的空缺（Gaps）作為堿基缺失處理；把所有的堿基狀態處理為無序，并給以相同的權重。自舉檢驗（bootstraping）重復1000次以獲得各分支的支持率，構建鄰近法（NJ）系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 病原菌菌落與形態特征

PDA培養基上菌落直徑為8.4-8.9cm，菌落邊緣整齊，輻射狀，氣生菌絲濃密，菌絲白色，呈疏松絨氈狀，中央為灰色至灰綠色，邊緣為白色（如圖2-1 A），菌落反面為深灰色至白色（如圖2-1B）。分生孢子橢圓、細長梭形、短梭形；無色、無油球；表面光滑；4.8～19.8×2.7～3.9μm（如圖2-2）。

Colletotrichum fioriniae首先被認為是尖孢炭疽菌（C.acutatum）的變種（C.acutata var.fioriniae）。本研究分離的代表菌株KLXYL-1-4的菌落形態、分生孢子形態與文獻描述一致，初步確認菌株KLXYL-1-4為Colletotrichum fioriniae(Marcelino&Gouli)R.G.Shivas&Y.P.Tan Fungal Diversity 39:117(2010)。

圖2-1 KLXYL-1-4培養基的菌落（A正面，B反面）

圖2-2 KLXYL-1-4的分生孢子

2.2 分子鑒定

本研究5個分離菌DNA為模板，對其肌動蛋白基因（ACT）和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）進行擴增并測序。NCBIBlastn比對后，確定5個菌株同屬于炭疽菌屬松針刺盤孢菌，與形態學鑒定結果一致。

代表菌株KLXYL-1-4的ACT和GADPH基因序列與其它同屬菌株序列經鄰接法（neighbor-joining，NJ）共同構建的系統發育樹中，KLXYL-1-4菌分別與松針刺盤孢菌（C.fioriniae）菌株KY986902.1和KF944354.1聚為一個獨立的進化枝，親緣關系置信度高達99%，能與同屬其它菌株明顯區分開。因此，根據分離所得鑒定結果將KLXYL-1-4菌株鑒定為C.fioriniae。

3 結論與討論

本文通過擴增KLXYL-1-4炭疽菌的ACT-GADPH序列，與GenBank中同屬其他菌株序列比對分析，聚類分析結果顯示，KLXYL-1-4株炭疽菌形成2個大的聚類群。在對菌株間的序列比較中，炭疽菌菌株間的序列同源性較高，但仍存在堿基的缺失和插入等堿基變異情況。

本研究分離得到的炭疽菌KLXYL-1-4，采用ACT-GADPH2個基因分子學鑒定，再結合形態學，確定KLXYL-1-4菌為松針刺盤孢菌（C.fioriniae），是貴州油茶上發現的炭疽病菌新種，增加了對貴州油茶主要栽培區炭疽病菌的了解，為進一步鑒定油茶炭疽病原提供了理論基礎。