茶樹‘龍井43’扦插不定根發生過程生理機制研究

左巧麗，谷 星，王超軍，魯占領，鮑 露

（西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100）

我國是世界上最大的產茶國，茶（Camellia sinensis）產業化的必經之路是實現良種無性繁殖，這種繁殖方式被廣泛應用于植物中，尤其是木本植物。目前，短穗扦插也成為茶樹無性繁殖的主要方式。茶樹扦插的成活率主要在于不定根的形成，茶樹不定根的產生過程，從形態上大致分為愈傷組織形成期、根原基形成期、根端伸長期以及根系形成期。它屬于一個復雜的生物學過程，并同時受到內外不同因素的調控。內在因素主要在于內源激素的變化、酶活性的變化以及酚類物質含量的變化等，而吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）是目前公認的與不定根關系最密切三種酶類。外在因素主要是環境因子，如溫度、光照、水分等。

有研究報道認為生長素對不定根的形成起著關鍵作用，在茶樹中，生長素萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）被廣泛應用于誘導不定根的形成，柴紅玲等發現NAA對茶樹扦插生根率的提高極顯著優于其他外源激素，但是關于NAA對茶樹不定根形成過程中的誘導的機理性研究還較少。本研究以‘龍井43’為試材，用300 mg/LNAA處理插穗，清水處理作為對照，研究扦插過程中相關的內源激素、酶活性（IAAO、PPO、POD）、茶多酚等多種指標變化，主要的目的是通過這些處理來得到在生根過程茶樹生理生化的動態變化，為加快茶樹扦插生根速率提高成活率提供理論參考和技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料

國家無性系良種‘龍井43’為試材，選擇當年生半木質化健壯、無病蟲害的枝條剪取插穗，于陜西省漢中貫山育苗基地進行試驗，插穗剪下后用300 mg/LNAA處理插穗底部30 min，同時以清水處理作為對照，每個處理設置3個重復，每個重復200株插穗。以扦插苗1 d、3 d、5 d、15 d、30 d、45 d以備使用，并測定生根過程中的內源激素含量、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）的活性、及茶多酚含量。

1.2 試驗方法

1.2.1 測定內源激素含量

內源激素含量的測定采用間接酶聯免疫法（ELISA）參考唐尚格的方法，其中包括脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）、吲哚乙酸（IAA）水平的測定。

1.2.2 測定酶活性

PPO活性的測定參考張正竹，酶活以每克樣每分鐘內A460增加0.1為一個活力單位，計算公式如下：酶活力，A代表反應終止時460nm的吸光度值，m代表干重g，t代表反應時間min。POD活性的測定參考劉萍的方法，在470nm波長處測定A470值的變化。IAAO活性以每克樣每分鐘內A470吸光度變化0.01為一個酶活力單位。IAAO活性以每毫升酶液每小時分解破壞IAA的量（ug）表示酶活力大小。

1.2.3 茶多酚含量的測定

采用酒石酸亞鐵比色法，茶多酚類物質能與亞鐵離子形成紫藍色絡合物，在一定波長下有最大吸收。在適當的濃度范圍內，多酚的含量與絡合物的吸光度成正比，故用分光光度法對茶多酚定量分析。

1.2.4 數據分析

用SPSS 17.0對數據進行單因素方差分析（ANOVA）。

2 結果與討論

2.1 結果

2.1.1 內源激素含量的變化

通過對根系內源激素含量的測定，可以看出經過NAA處理的扦插苗和清水對照處理的扦插苗（圖1）。扦插苗插穗的ABA含量在扦插的過程中有短暫下降的過程，1～5 d的時候，開始出現上升，之后又再次出現降低，無論是哪種處理，30 d的時候又進入上升的趨勢（圖2）。經過NAA處理的扦插苗的插穗與對照處理的扦插苗的插穗的韌皮部內源GA3活性變化一致，先降低，再高升，后降低的趨勢（圖3）。經過NAA處理的扦插苗的插穗的ZR含量在第5d的時候出現了高峰，而對照處理的扦插苗的插穗的ZR含量的高峰期在第30d的時候出現（圖4）。

2.1.2 酶活性變化

生根的前期NAA處理和CK插穗中

PPO的活性均在第15 d達高峰，然后出現急劇下降的現象（圖5）。POD活性的變化，在兩個處理中均表現出下降→上升→下降→上升的變化趨勢，但NAA處理的較對照有所提高（圖6）。插穗中IAAO的含量變化情況如圖7，清水對照處理的插穗葉片和NAA處理插穗葉片IAAO活性均出現先升后降變化情況。

2.1.3 茶多酚含量變化

對照處理插穗茶多酚含量下降，上升，下降的情況，與NAA相反，茶多酚的含量呈現出下降→上升→下降→上升趨勢（圖8）。這種情況的出現多是PPO活性升高然后可能催化IAA和酚類物質形成“IAA-酚酸復合物”，最終使茶多酚下降。

2.2 討論

2.2.1 內源激素的變化與不定根的形成

扦插后第1 d IAA含量大幅度下降，主要原因可能是與早期的細胞分裂與根原基的組建有關，第30 d時，NAA插穗中的IAA含量高于對照，達到了最高峰（圖1）。說明IAA初期的升高在根愈傷形成及不定根發生過程中非常重要。在生根的過程NAA插穗的內源IAA的含量高于對照，生根率也遠遠高于對照。由外源生長調節劑NAA處理的插穗中的內源IAA可能被促進，從而有利于不定根發育和伸長。促進不定根的形成萌發與伸長生長的激素極有可能是內源激素IAA，與形成層形成位點誘導和第1次細胞分裂啟動有很大關系。ABA的含量前期出現上升的情況（圖2），主要可能是降低逆境對插穗的損傷的原因。在愈傷組織誘導期和根源基誘導期，5～30 d的時候出現了明顯的下降，這種情況說明低濃度的內源ABA對茶樹生根有促進作用。ABA是植物體內一種抑制性植物激素，但是低濃度的ABA有促進植物生根的作用，高濃度ABA抑制IAA的運輸和離體器官的生長，抑制生根的形成。GA3含量無論是對照還是處理，在第15～30 d都出現明顯的下降（圖3），此階段根的愈傷明顯形成，說明低濃度的GA3在根愈傷形成期間起到了重要作用，與前人研究結果一致。NAA處理可以將ZR的高峰期提前（圖4）。

2.2.2 酶活性的變化與不定根的形成

NAA處理的插穗PPO活性高于對照（圖5）。PPO對于IAA與酚類物質的快速縮合而形成“IAA-酚酸復合物”有催化作用，這種復合物對不定根形成萌發和伸長生長有促進作用。PPO變化的趨勢（圖5）可以明白在不定根形成的早期PPO活性高，后期PPO活性顯著下降，說明PPO對根原基形成起著重要作用。NAA處理插穗POD活性變化趨勢和對照處理插穗接近一致，呈先下降，再上升，后下降，最后上升，但與對照相比提高了（圖6）。在茶樹根誘導期，POD活性上升氧化IAA，消除了插穗體內過多內源IAA，有利于誘導根原基的發育。插穗的POD活性出現下降，使插穗體內IAA含量出現上升的情況，對不定根的形成有促進，隨后POD活性出現升高。就IAAO活性變化水平而言，對照處理低于激素NAA處理（圖7），變化的趨勢也更為簡單。IAA分解的專一性的酶是IAAO，這種酶通過O2對IAA氧化。高活性IAAO對植物體內IAA的水平有降低的功效。

2.2.3 茶多酚含量變化與不定根的形成

生根過程NAA處理的插穗的茶多酚含量的變化與對照變化的趨勢稍有不同（圖8）。

3 小結

茶樹插穗內源激素通過自我調控變化達到有利于生根的水平。插穗在剛開始時（脫離母體），內源激素等物質會迅速由葉片向生根部位進行運輸。而且在傷口部位過氧化物酶活性會增強，在愈傷組織形成及根原基孕育期IAA，ZR含量不斷增加、積累并維持在較高水平,以誘導生根，生根后下降，以利于生長；研究結果顯示：內源激素與不定根的產生表現出不同的相關性：其中高含量的IAA、IAA/ABA與不定根產生成正相關，ZR、GA3、ABA與不定根的產生成負相關；就吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）的活性而言，經過NAA處理的插穗高于對照插穗；生根過程NAA處理的插穗的茶多酚的含量呈現出的趨勢為下降→上升→下降，對照的趨勢與NAA正好相反，茶多酚的含量呈現出下降→上升→下降→上升的趨勢。