生物質炭與噬菌體聯用阻控與滅活土壤–生菜體系中抗生素抗性致病細菌①

趙遠超，葉 茂，孫明明，張忠云，黃 丹，朱國繁,3，鄭曉璇，晁會珍，馮彥房，武 俊*，胡 鋒，蔣 新

生物質炭與噬菌體聯用阻控與滅活土壤–生菜體系中抗生素抗性致病細菌①

趙遠超1,2，葉 茂2*，孫明明1，張忠云2，黃 丹2，朱國繁2,3，鄭曉璇1，晁會珍1，馮彥房4，武 俊1*，胡 鋒1，蔣 新2

(1 南京農業大學資源與環境科學學院，南京? 210095；2 中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008；3 合肥工業大學資源與環境工程學院，合肥 230009；4 江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所，南京 210014)

農田土壤–蔬菜體系中殘留和滋生的多種抗生素抗性致病細菌已對人體健康和生態環境安全造成較嚴重的隱患，因此開展針對性的風險管控技術研究十分迫切。生物質炭阻控與農業噬菌體療法聯用靶向滅活土壤–蔬菜體系中抗生素抗性致病細菌，為解決此類污染土壤問題提供了全新途徑。本研究以自主制備的抗生素抗性致病細菌(攜帶四環素抗性基因W的大腸桿菌K12，攜帶氯霉素抗性基因C的銅綠假單胞菌PAO1)污染農田土壤為盆栽用土，開展生菜土培試驗60 d。設置單獨或同時添加生物質炭和接種廣宿主型噬菌體(YSZ?5K)的不同處理，以土壤–生菜體系中K12、PAO1數量變化及W、C豐度消減程度表征聯合修復的效果。結果表明，針對土壤–生菜體系中殘留K12、PAO1和W、C消減程度變化，判斷不同處理效果，依次為：BP(生物質炭與噬菌體聯用)> B(單獨施用生物質炭)>P(單獨接種噬菌體)> CK(對照)，其中BP處理條件下，K12與PAO1在土壤和生菜葉片中數量較之對照處理下降了2.1 ~ 3.1個數量級，W和C豐度較之對照處理下降了2.2 ~ 3.3個數量級。此外，在BP處理條件下，生菜收獲后，土壤微生物群落結構與功能多樣性和穩定性指數也得到顯著提升，證明該聯合治理方式是一種較為環境友好的修復技術。本研究結果可為降低土壤–蔬菜體系中抗性致病細菌的殘留風險提供科學的理論依據和有效的管控技術。

土壤–蔬菜體系；生物質炭；農業噬菌體療法；抗生素抗性致病細菌

由于抗生素類獸藥的濫用、畜禽糞便安全化處理技術的不足及環境管理的缺失，中國及世界范圍內許多國家的城郊畜牧業養殖廠周邊農田土壤-蔬菜系統，常成為殘留和滋生抗生素抗性細菌(antibiotic resistance bacteria，ARB)和抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的高風險熱點“源”和“匯”，尤其是在大量環境中可移動基因元件(質粒、整合子、轉座子)水平轉移或垂直轉導的促進作用下，一些人畜共患抗生素抗性致病細菌的擴散傳播風險更會大大增加，同時給人體健康和生態安全帶來了極為嚴重的潛在威脅[1-2]。因而，開展針對性降低風險的阻控技術和消除風險的生物靶向滅活技術研發已十分迫切和必要。

生物質炭(biochar)是一種多孔隙、吸附能力強、可提供土著微生物著床的環境友好型功能材料[3]。有研究表明，在畜禽養殖場周邊農田土壤、醫療廢棄物處理廠和垃圾填埋場周邊覆土中，添加生物質炭可高效廣譜性協同阻控多種ARB和ARGs在土壤-植物體系中的傳播路徑、傳播頻率和傳播距離，環境中ARB和ARGs的擴散風險在生物質炭的阻隔、吸附、促消減作用下得到有效降低[4-6]。然而，基于生物質炭的阻控技術雖可以顯著降低風險，但并未從根本上消除風險。仍然需要進一步研發深度滅活土壤-植物體系中抗生素抗性致病細菌的生物靶向修復技術。

噬菌體療法的出現為解決上述問題提供了一種全新途徑。細菌噬菌體(簡稱噬菌體)是一類專屬性捕食活體宿主細菌而存活的生物體，在土壤、水、空氣乃至人和動物體表或腸道內均廣泛分布，據估算其總量達到1031數量級[7-8]。噬菌體療法是指通過分離、篩選、純化和富集宿主細菌的專屬噬菌體之后，向污染土壤-植物體系中添加特定噬菌體菌液，定向侵染并滅活抗性致病細菌的修復方式[9-11]。已有學者成功將噬菌體療法應用在滅活葡萄、辣椒、番茄等果蔬的植物病害細菌或人畜共患致病細菌的食品安全保障領域[12-14]。此外，前期研究常認為噬菌體僅限于侵染某一“種”類的宿主細菌，但近年來學術界越來越多的發現：噬菌體經過適當的基因改造或人工加速定向馴化后，可針對同一“屬”內幾種高度同源性的宿主細菌，甚至針對不同種屬之間的宿主細菌也具有一定廣譜性捕食區間[15-17]。這為噬菌體療法進一步廣泛應用奠定了堅實的理論基礎。

基于上述研究背景，本研究將自主制備復合抗生素抗性致病細菌污染土壤，模擬實際污染土壤現狀，進行生菜土培試驗。探究單獨及聯合使用生物質炭阻控技術和廣宿主型噬菌體療法滅活技術，協同消除土壤-生菜體系內復合抗性致病細菌的過程與效果。同時基于修復過程中土著細菌群落結構組成和功能多樣性變化，綜合評價此聯合修復技術的環境效應。本研究結果可為同步高效阻控和深度靶向滅活農田土壤-蔬菜體系中多種致病細菌的環境風險，提供環境友好、行之有效的生物修復技術，具有廣泛應用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試品種 生菜為意大利全年耐抽苔生菜(L.)，河北金發種業有限公司。

1.1.2 供試土壤 采自南京城郊某奶牛場(32°30′ 45″N，118°94′7″E)附近農田土壤，采用五點取樣法，取0 ~ 10 cm的表層土壤，于暗處4 °C冷藏保存。測定土樣基本理化性質[18]：沙粒238 g/kg，壤粒454 g/kg，黏粒318 g/kg，pH 7.7，全氮1.7?g/kg，水溶性氮1.7?g/kg，全磷1.3?g/kg，全鉀17.5?g/kg，CEC 19.4?cmol/kg。

1.1.3 供試生物質炭 由江蘇省農業科學院面源污染治理與水體修復研究室提供，以玉米秸稈為原料，300 ℃高溫燒制，測定其基本理化性質[19]：全碳556.4?g/kg，全氮13.6?g/kg，C/N?35.6，灰分186.5?g/kg，全磷2.3?g/kg，全鉀11.6?g/kg，pH?9.5。

1.1.4 供試菌株 攜帶四環素抗性基因W和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的大腸桿菌K12(K12)與攜帶氯霉素抗性基因C和紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因的銅綠假單胞菌(PAO1)及廣宿主型噬菌體YSZ?5K(頭長徑約110?nm，橫徑約80?nm，尾長約120?nm；最佳感染復數MOI = 0.1)均為南京農業大學土壤生態實驗室提供。

1.1.5 試驗儀器與試劑 激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica?DM?5000B)，實時熒光定量PCR儀(Applied?Biosystems?StepOnePlusTM)，BIOLOG(MicroStation TM，型號：14060316，華粵行儀器有限公司)，恒溫培養箱，Luria-Bertani(LB)培養基。

1.2 試驗設計

本研究采用溫室盆栽試驗，每個盆缽稱取8?kg供試土壤，每個盆缽中同時接種100 ml濃度為107cfu/ml的K12(GFP，W)和PAO1(RFP，C)菌液，制備獲得原始抗性致病細菌污染土壤。設有4組處理：①對照組(CK)：每盆種植3棵生菜(在種子上覆土0.5 ~ 1 cm，室溫18℃±2℃)；②生物質炭處理(B)：在對照組基礎上添加生物質炭(10 g/kg)；③噬菌體處理(P)：在對照組基礎上接種100 ml濃度為108pfu/ml的廣宿主型噬菌體YSZ 5K；④生物質炭和噬菌體聯合處理(BP)：在對照組基礎上添加生物質炭并接種噬菌體YSZ 5K。每隔3 d澆水，保持田間最大持水率的75%。每隔10 d，在生菜根部附近隨機采集5個土樣，共取樣10 g土壤，混合均勻后，待測。并在第60天時采集新鮮生菜，去除根部附著土壤，在根與葉連接的成熟區剪斷，于暗處4 ℃低溫儲藏[20]。

1.3 噬菌體療法在土壤中滅活抗性致病細菌的效果

將土壤樣品與100 ml無菌水混勻，振蕩5 min，浸提10 min，取100 μl懸液稀釋到適當濃度，并在LB平板上涂布計數，對K12和PAO1數量進行測定。

1.4 噬菌體療法對土壤中抗性基因消減變化的研究

用土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA? Spin Kit For Soil，貨號：116560200)提取土壤基因組DNA，用微量分光光度計NanoDrop 測定提取的土壤DNA 的純度(OD260/OD280在1.8 ~ 2.0之間)和濃度。用qPCR(StepOnePlusTM RealTime PCR system)對W、C基因進行豐度的定量分析(表1)。原始土壤中W、C檢測為陰性。

1.5 噬菌體療法對生菜中抗性致病細菌和抗性基因的影響

用激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710)，觀測不同處理條件下，新鮮生菜根和葉片中K12和PAO1的賦存狀態和定殖情況；取待測植物樣品用無菌水漂洗3 ~ 4次，剪碎后放入盛有4 ml無菌水的研缽中充分研磨，靜止后取上清，用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit，貨號：dp302-02)提取內生細菌總DNA，并用qPCR(StepOnePlusTM RealTime PCR system)對W、C基因豐度進行測定。

表1 抗性基因tetW和ampC的PCR 擴增引物序列

1.6 土壤微生物群落功能的多樣性和穩定分析

將1.2中采集的土壤樣品，進行微生物群落功能多樣性和穩定性分析。土壤微生物群落功能多樣性采用Biolog?ECO測定法[21-22]。Biolog?ECO微平板中多底物酶聯反應采用每孔的平均吸光度值(average?well?color?development，AWCD)來描述。

式中：C代表含底物試驗孔的吸光值，代表不含底物對照孔的吸光值，31表示本試驗中有31種碳源。土壤群落功能多樣性采用培養Biolog ECO微平板孔中吸光值，計算土壤微生物群落功能多樣性指數(Shannon指數()和Simpson指數())。

式中：p為第孔相對吸光值(-)與整個微平板相對吸光值總和(∑OD)的比率。

1.7 數據處理

所用數據均為3次重復采樣的平均值，利用軟件SPSS 21進行數據統計分析。圖表采用Microsoft Excel 2016和軟件OriginPro 9.0繪制。

2 結果與討論

2.1 噬菌體療法對土壤中抗性致病細菌的滅活效果

由于本研究所使用的K12和PAO1分別標記有穩定遺傳的綠色熒光蛋白基因和紅色熒光蛋白基因，因而采用平板涂布計數法，可對K12和PAO1數量動態變化規律進行監測。如圖1所示，不同處理條件下，土壤中K12和PAO1消減程度從高到低順序依次是：BP>P>B>CK，這可能是由于生物質炭是一種環境友好的土壤改良材料，已有較多研究表明添加生物質炭可以有效改善土壤益生菌群在總體土著菌群中的多樣性、代謝活性和生態位比例[23-24]。因而相較于CK處理來說，單獨添加生物質炭的B處理，土壤中K12和PAO1的數量得到顯著抑制(<0.05)。另外，單獨接種噬菌體的處理，第 60天時，土壤中K12和PAO1殘留豐度分別為5.1×104cfu/g和5.63×104cfu/g，該結果直接驗證了廣宿主型噬菌體療法在土壤中具有同步靶向滅活復合抗性致病細菌的能力；相較于單獨添加生物質炭處理(B)或單獨接種噬菌體處理(P)，BP處理具有更為顯著的協同滅活效果(<0.05)，K12和PAO1的殘留數量相較于原始接種量分別下降了2.5和2.1個數量級，分別僅為4.65×104cfu/g和5.15×104cfu/g。這可能是由于土壤中添加的生物質炭不僅可以通過吸附、阻隔作用主動持留一部分抗性致病細菌，同時生物質炭自身的多孔結構和富含養分元素也可以讓抗性致病細菌在土壤微域環境形成相對密集的定殖區域，再加上外界的廣宿主型噬菌體的引入，充分增加噬菌體接觸到宿主致病細菌的概率，節約噬菌體尋找宿主時間和縮短噬菌體尋找宿主路徑[25]，這樣更有利于噬菌體快速侵染并滅活復合致病細菌，達到消除風險的作用。

2.2 噬菌體療法對土壤中ARGs豐度消減變化的影響

土壤中過量豐度ARGs存在，能通過食物鏈直接或間接傳遞作用增加人體獲得抗生素抗性的風險，故而ARGs也被認為是一種新型環境生物大分子污染物。本研究同時關注不同處理條件對土壤中ARGs豐度消減的影響。從圖2可以看出，各組處理下土壤中ARGs豐度的消減動態與K12和PAO1數量的消減動態接近一致。即：單獨或同時添加生物質炭和接種噬菌體處理，對土壤中ARGs的消減有顯著效果(<0.05)；同時添加生物質炭和接種噬菌體處理(BP處理)對于深度消除土壤中ARGs具有顯著的協同效應(<0.05)，在BP處理下，土壤中ARGs消減最為顯著，兩種ARGs豐度下降幅度分別為2.2和3.2個數量級，其中W基因豐度由第1天的2.3×108copies/g下降到第60天的2.2×105copies/g，而C基因豐度由6.6×107copies/g下降到5.6×105copies/g。這可能是由于本研究檢測到的土壤中關于四環素抗性的W基因都是存在于活體K12體內，而檢測到的關于氯霉素抗性的C基因存在于活體PAO1體內，所以當不同處理條件對土壤中K12和PAO1的增殖活性產生顯著抑制或者大幅度滅活殘留數量后，相應ARGs豐度也隨之減弱。

(CK：對照組；B：單獨添加生物質炭處理；P：單獨添加噬菌體處理；BP：生物質炭與噬菌體聯用處理，下圖同)

圖2 污染土壤中抗性基因tetW與ampC的動態變化

2.3 生物質炭與噬菌體療法聯用追蹤滅活生菜體內抗性致病細菌和抗性基因

ARB/ARGs從土壤向植物體內遷移富集的過程增加了人類在食物鏈上直接接觸到抗性致病細菌的風險。為探究生物質炭與噬菌體療法聯用在污染土壤-生菜體系中的實際應用，本研究使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀測生菜根和葉片中K12和PAO1的賦存狀態和定殖情況(圖3)。由圖3可知：不同處理條件下，根部中定殖殘留的K12(綠點)與PAO1(紅點)數量要顯著高于葉片中殘留的K12與PAO1數量(< 0.05)；定殖的K12和PAO1主要分布和集中在植物真核細胞的間隙，尤其是較多地聚集在根部和葉片的氣孔周圍；不同處理條件對根葉中賦存K12和PAO1的影響具有一致的規律，即：根葉中賦存的K12和PAO1數量由高到低的順序依次是：CK>B>P>BP。上述結果說明單獨添加生物質炭可以有效降低K12和PAO1從土壤向生菜組織中的遷移富集；而單獨接種噬菌體則是因為一方面高效靶向滅活了土壤中的K12和PAO1，另一方面也可能由于接種的噬菌體也具有自主的移動性，同樣可以通過根系氣孔或機械損傷部位遷移進入植物體內，從而深度追蹤滅活生菜體內的復合致病細菌；對于BP處理來說，生物質炭在土壤中的協同阻控效應和噬菌體療法靶向追蹤滅活效應的疊加，更為直觀地說明了該聯合修復方法的高效。

圖3 第60天時生菜根和葉中K12(綠點)和PAO1(紅點)的豐度變化(40x/0.75)

進一步具體分析生菜組織中殘留ARB和ARGs的情況，本研究對根葉中K12和PAO1進行了定量計數和ARGs熒光定量分析。第60天生菜收獲后，根/葉鮮樣中K12和PAO1的累計定殖總數量由高到低為：CK>B>P>BP(圖4)，與土壤中抗性細菌變化規律相似；單獨或同時添加生物質炭和接種噬菌體，都可以顯著消減生菜根葉中復合致病細菌的殘留，并且賦存狀態與圖3中顯微鏡觀測到的殘留規律一致，其中BP處理最為顯著(<0.05)，殘留在生菜根葉中的K12和PAO1累計總量分別下降到5.1×104、1.9×103cfu/g。根據這一規律深入分析第60天時不同處理條件對殘留在根葉中ARGs豐度的變化(圖5)，發現：第60天時，CK處理下根和葉鮮樣中W與C累計總豐度分別可以達到5.3×106、5.1×105copies/g；而在BP處理中，根葉中殘留ARGs豐度消減最為顯著(<0.05)，W和C累計豐度較之CK下降了6.2和5.7個數量級，分別僅為4.3×103copies/g、1.8×102copies /g。上述結果綜合證明了生物質炭阻控和噬菌體療法靶向滅活的聯合修復技術，可以靶向追蹤消除土壤-生菜體系中K12和PAO1復合抗性致病細菌的殘留滋生風險，是一種行之有效的風險消除技術。

圖4 不同處理條件下生菜根(A)、葉(B)中K12和PAO1的賦存數量

圖5 不同處理條件下生菜根(A)、葉(B)中tetW和ampC的殘留豐度

2.4 噬菌體療法對土壤微生物群落多樣性的影響

噬菌體療法在滅活土壤-生菜體系中抗性致病細菌的同時，可能對土壤中其他益生菌群或整體微生物群落結構和功能多樣性造成一定程度的影響，因此進行土壤生態風險評估十分必要[26]。AWCD數值的變化表示土壤微生物整體代謝活性的波動；豐富度指數Shannon()反映的是群落的豐富度, 其值越小表示樣性越低；優勢度指數Simpson()反映土壤微生物群落常見種的優勢度變化，數值越大其微生物多樣性越低。第60天后不同處理下土壤Biolog?ECO測定結果見表2。

表2 不同處理方式土壤微生物群落功能多樣性指數(第 60 天)

注：表中同列數據小寫字母不同表示處理間差異顯著(<0.05)。

AWCD值由高到低表現為BP>B>CK>P，而Shannon指數和Simpson指數也佐證了這一規律(表2)，即：單獨添加生物質炭對土壤微生物多樣性有所增強，這可能是由于生物質炭是溫和友好的土壤環境改良劑，可以大幅度改善土壤水熱通氣條件和養分循環周轉過程，增強微生物活性，提高土壤微生物群落多樣性；單獨接種噬菌體后對土壤微生物多樣性略有下降，這可能是由于接種的廣宿主型噬菌體在進入實際土壤后為繼續存活，拓寬了其捕食區間，從而對土壤細菌群落的多樣性造成一定程度的減少；而同時添加生物質炭和接種噬菌體后土壤微生物多樣性顯著增強(<0.05)，這可能是由于生物質炭能夠同時吸附土著菌群和噬菌體，縮小噬菌體活動區間，提高其靶向滅活致病細菌的效率，進而增強生物質炭吸附效果，促進土壤中有益菌群的增長。這證明了生物質炭施用與噬菌體療法聯合使用對于維持土壤-生菜體系中細菌群落結構組成多樣性具有良性貢獻。上述結果共同證明施用生物質炭和接種噬菌體的聯合技術對于同步維護土著微生物群落結構和功能穩定性具有積極的作用，可以大幅度消減噬菌體療法在應用過程中對生態環境造成的潛在負面風險。

3 結論

本研究發現同時添加生物質炭和接種廣宿主型噬菌體的聯合方式，不僅可以高效廣譜地阻控四環素抗性的K12和氯霉素抗性的PAO1從土壤向生菜體內遷移富集的過程，還可以靶向追蹤滅活土壤-生菜體系中定殖的K12與PAO1及消減相應攜帶的ARGs豐度。此外，該聯合修復方式對于維護土壤微生物群落結構組成多樣性和功能穩定性也具有積極作用，是一種環境友好、生態安全的修復技術，可以為深度消除土壤-蔬菜系統中ARB和ARGs的擴散傳播和定殖殘留風險提供一種全新思路，具有廣泛的應用前景。

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Combined Biochar and Bacteriophage to Control and Inactivate Antibiotic Resistance Pathogenic Bacteria in Soil-Lettuce System

ZHAO?Yuanchao1,2, YE Mao2*, SUN Mingming1, ZHANG Zhongyun2,HUANG Dan2,ZHU Guofan2,3, ZHENG Xiaoxuan1,CHAO Huizhen1, FENG Yanfang4, WU Jun1*,HU Feng1, JIANG Xin2

(1 College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 3 School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 4 Institute of Agricultural Resources and Environment, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

Ubiquitous existence of antibiotic resistant pathogens (ARP) in the agricultural land and vegetation system has posed great threat against public health and environmental safety, making it essential to develop targeted controlling technologies. In this work, biochar and bacteriophage combined technology was investigated for its effectiveness in targeted inactivating the ARP in the soil-lettuce system. Biochar and polyvalent phage YSZ 5K were applied to the ARP (tetracycline resistantK12 and chloramphenicol resistantPAO1) contaminated soil. The residual K12 and PAO1 counts and antibiotic resistance genes (W andC) abundances were determined after 60 days of incubation. The results showed that the combined technology was proved most effective, followed by sole application of biochar, sole inoculation of YSZ 5K, and the control. For the combined treatment, the counts of K12 / PAO1 decreased by 2.1–3.1 magnitudes and the abundances ofW/C decreased by 2.2–3.3 magnitudes in the soil and lettuce leaves, respectively. In addition, the structural and functioning diversity of soil microbial community was improved significantly after the combined treatment. The results obtained here demonstrate the combined application of biochar and polyvalent phage YSZ 5K an environmentally-friendly technology that could effectively decrease the ARP in the soil-lettuce system.

Soil-vegetable?system;?Biochar;?Agricultural?phage?therapy;?Antibiotic?resistant?pathogenic?bacteria

國家重點研發計劃項目(2018FYC1803100)、2017年度江蘇省環保科研重點項目(2017005)、2017年江蘇省農業科技自主創新資金項目(CX(17)3047)、國家自然科學基金面上項目(41771350)和中國科學院青年創新促進會項目(2018350)資助。

yemao@issas.ac.cn；wujun2013@njau.edu.cn)

趙遠超(1993—)，男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事噬菌體分離純化、定向進化及農業噬菌體療法在抗性致病細菌污染土壤中的靶向滅活研究。E-mail: 2016103027@njau.edu.cn

S154.1；Q938.1+3

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.05.014