葉面噴施含Bacillus amyloliquefaciens SQR9復合微生物液體肥料的肥效研究①

盧云峰，許 航，段華泰，梅新蘭，李 榮，管曉進，張 楠，沈其榮

葉面噴施含SQR9復合微生物液體肥料的肥效研究①

盧云峰1，許 航1，段華泰1，梅新蘭1，李 榮1*，管曉進2*，張 楠1，沈其榮1

(1 江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術研究重點實驗室/江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心/國家有機肥類肥料工程技術研究中心/南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095；2 生態環境部南京環境科學研究所，南京 210042)

研究葉面噴施含SQR9復合微生物液體肥料在辣椒和白菜上的應用效果，以期開發出根際有益微生物新的應用模式和新的葉面肥產品。以辣椒和白菜為供試材料，設以下6個處理評估肥料效果：噴施清水處理(CK)、噴施與復合微生物液體肥料等養分的化肥處理(CF)、噴施含化肥+氨基酸+糖蜜的水溶肥處理(T1)、噴施含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素的水溶肥處理(T2)、噴施含化肥+氨基酸+糖蜜+SQR9的水溶肥處理(T3)和噴施含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素+SQR9的復合微生物液體肥料處理(T4)。盆栽試驗結果表明，與其他5個處理(CK、CF、T1、T2、T3)相比，T4處理在各項促生指標上雖未全部達到顯著性差異，但其更能夠促進辣椒和白菜的生長，提高其生物學性狀。可培養微生物數量上，新型含菌株SQR9復合微生物液體肥料的噴施，增加了葉際芽孢桿菌的數量；與噴施清水對照(CK)和與復合微生物液體肥料等養分的化肥處理(CF)相比，其他4個處理(T1、T2、T3、T4)對辣椒和白菜葉際可培養微生物數量影響更大，而噴施含SQR9復合微生物液體肥料(T4)的影響更為明顯。葉面噴施含SQR9復合微生物液體肥料可有效促進辣椒和白菜的生長。

解淀粉芽孢桿菌SQR9；微量元素；葉面噴施；玉米；白菜；復合微生物液體肥料

復合微生物肥料是指由兩種或兩種以上互不拮抗的有效微生物或有特殊功能的單一微生物(固氮、溶磷、解鉀類微生物)與一些營養物質加工復合而成的微生物制品，其應用于農業生產后，能獲得特定的肥料效應，其制品中的活性微生物為發揮作用的關鍵，分為液體劑型和固體劑型[1-3]。復合營養物質的復合微生物肥料因其具有改良土壤、增加作物產量和改善品質、提高植株的抗逆性和抗病蟲害能力、對微生態環境起保護作用等特點[4-7]，其研究和應用越來越受到人們的關注和認可。因含有一定量的養分，復合微生物肥料液體劑型中的功能菌在肥料中易于死亡，數量和活性下降，影響了肥料的效果，也因此得到科研、生產等各界的廣泛關注。近年來，對復合微生物液體肥料的應用研究主要是集中在根部灌施方面[8-11]，在葉面噴施方面的研究還比較少，而葉面噴施養分全面、針對性強、肥料用量少、肥料利用率高、肥效快[12-13]，因此，對復合微生物液體肥料葉面噴施方面的研究同樣具有重要意義。

植物根際益生菌(plant growth-promoting rhizo-bacteria，PGPR) 是一類能夠在植物根際有效定殖，不僅對植物生長和增收有直接或間接促進作用，還能對植物病害有一定防控作用的一類有益微生物的統稱[14]。傳統根際有益微生物的應用模式主要為根際灌施或制成生物有機肥施入土壤[15]。近年來，隨著研究的不斷深入和市場的需求，植物根際促生菌的概念和研究范圍，已從根際擴大至葉圍的研究領域[16]。解淀粉芽孢桿菌() SQR9是本實驗室從黃瓜根際分離篩選獲得、并鑒定保存的一株適應能力較強的革蘭氏陽性菌，它能夠在植物的根際有效定殖促進植物生長和防控土傳病害[17]。將菌株SQR9接入到秸稈、動物糞便等一些有機物料中進行腐熟堆肥制成的生物有機肥已經被廣泛地應用于農業生產中，且在促進作物生長、增收和防控土傳病害等方面取得了顯著的效果[18-20]。但迄今為止，仍然還未有葉面噴施該功能菌株的研究。

本研究在以上背景下，選擇SQR9為目標菌株，以酸解廢棄豬毛所制成的氨基酸為主要原料，鰲合一定量的微量元素，配比一定量的養分和糖蜜研制成含SQR9復合微生物液體肥料，并通過在辣椒和白菜葉面噴施，研究該新型水溶肥料的促生效果，以期開發出根際有益微生物新的應用模式和新的葉面肥產品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試微生物 供試功能微生物為本實驗室分離保存的具有防控土傳病害和促進植物生長的根際促生解淀粉芽孢桿菌SQR9(SQR9)[18]，該菌株為革蘭氏陽性菌，寄存于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.5808。

1.1.2 供試培養基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 ml，pH 6.5 ~ 7.0；完全溶解后分裝到三角瓶，115 ℃滅菌 30 min。

1.1.3 供試氨基酸 氨基酸水解液由本實驗室研制，主要通過酸解廢棄豬毛制得，總氮(N)含量28.4 g/kg，全磷(P2O5)含量0.76 g/kg。

1.1.4 供試作物 辣椒(超大甜椒王)和白菜(精純改良青雜三號)種子均購自江蘇省農業科學院。

1.1.5 供試肥料 腐熟雞糞有機肥由南通惠農生物有機肥有限公司提供，含水量20%，有機質≥45%、全氮1.31%、全磷(P2O5)2.64%、全鉀(K2O)1.55%。供試化肥：氮肥為尿素(含N 46.4%)，磷鉀肥為磷酸氫二鉀(含K2O 54.0%、含P2O517.8%)。

1.2 試驗設計

1.2.1 復合微生物液體肥料的制備 ①將菌株SQR9接種到LB培養液中液體發酵生產，使發酵液中含菌或芽孢量≥1×109cfu/ml；②用200 ml氨基酸分別鰲合微量元素，微量元素含量分別為Fe 0.6%、Mn 0.5%、B 0.2%、Zn 0.5%、Cu 0.3% 和M 0.05%；③將尿素、磷酸氫二鉀、糖蜜、鰲合了微量元素的氨基酸、去離子水混合攪拌均勻，用KOH調節pH至4.0 ~ 4.5。其中，尿素、磷酸氫二鉀、糖蜜、氨基酸液和去離子水的量分別為100 g、50 g、200 ml、200 ml和400 ml；④往攪拌均勻、調節好pH的液體肥料中添加3% 的表面活性劑，并攪拌均勻；⑤將步驟①制備的菌株SQR9發酵液接種到步驟④制備的液體肥料中，接種量為10%，并定容至1 L，測得總養分為100 g/kg(包括液體氨基酸所含養分)，即得成品復合微生物液體肥料。

1.2.2 盆栽試驗設計 盆栽試驗于2017 年9—10月在江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術研究重點實驗室溫室內進行，供試土壤采自江蘇宜興，基本性質如下：pH 7.24，有機質15.44 g/kg，全氮1.96 g/kg，全磷1.62 g/kg，全鉀11.58 g/kg，有效磷21.26 mg/kg，速效鉀86.53 mg/kg。供試作物為辣椒和白菜，共設6個處理：處理1(CK)：噴施清水；處理2(CF)：噴施與復合微生物液體肥料等養分的化肥；處理3(T1)：噴施含化肥+氨基酸+糖蜜的水溶肥；處理4(T2)：噴施含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素的水溶肥；處理5(T3)：噴施含化肥+氨基酸+糖蜜+SQR9的水溶肥；處理6(T4)：噴施含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素+ SQR9的復合微生物液體肥料。每個處理9個重復，每個盆缽裝土3 kg ，添加1%(肥料干重/土干重)的腐熟雞糞有機肥與土拌勻作為基肥，選取長勢均一的種苗移栽。于移栽7 d后開始噴施肥料，6 d噴施一次，共噴施3次，均按500倍稀釋噴施，噴施時間為晴天的早上、傍晚或者陰天進行。

1.3 測試項目及方法

1.3.1 生物學性狀的測定 于移栽后35 d時測定各處理的株高、莖粗、葉綠素相對含量測量值(SPAD值)、葉長、葉寬、葉片數、地上部鮮質量和干質量、地下部鮮質量和干質量。株高、莖粗和SPAD 值分別選用鋼卷尺、得威斯游標卡尺和TYS-A 型葉綠素測定儀進行測定；葉長、葉寬選用直尺進行測定；地上部鮮質量和干質量、地下部鮮質量和干質量用百分之一天平進行測定，將稱完鮮重后的植株放置于牛皮紙袋中于105 °C下殺青15 min后，于70 °C下烘干至恒重，稱重[21]。

1.3.2 辣椒和白菜葉際中芽孢桿菌、細菌和真菌數量的測定 芽孢桿菌采用半選擇性培養基涂布測定[22-23]，培養基配方如下：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂2.5%、去離子水1 000 ml，pH 7.2 ~ 7.4，121 ℃高壓滅菌20 min。1% 多粘菌素2 ml/L、1% 放線菌酮4 ml/L(抗生素在培養基倒前冷卻后加入)。測定步驟如下[24]：各處理分別取相同葉位的新鮮葉片 5 g，無菌環境下剪碎放入裝有 45 ml 無菌水的三角瓶內，勻漿2 min，再用超聲波震蕩2 min 混勻[25]。將樣品稀釋成不同梯度稀釋液后，用無菌吸管各取0.1 ml涂布于相應培養基平板中，于30 ℃培養36 h 后計數。細菌培養采用牛肉膏蛋白胨固體培養基[24]，真菌采用馬丁-孟加拉紅培養基[26]，葉際中可培養細菌和真菌數量的測定操作步驟與芽孢桿菌相同。細菌和真菌分別于30 ℃和28 ℃培養36 h 和72 h 后計數。菌落統計結果均以cfu/g 鮮葉重表示。

1.4 數據分析

采用Excel 2010和SPSS 13.0軟件進行數據統計分析，使用最小顯著差異法(least significant diffe-rence，LSD) 檢驗進行多重比較(<0. 05)。

2 結果與分析

2.1 噴施不同肥料對辣椒生物學性狀的影響

不同處理對辣椒生物學性狀的影響如表1所示。在株高和莖粗方面，噴施復合微生物液體肥料處理(T4)優于其他處理，且具有顯著性差異；T3與T1間無顯著性差異，但指標均高于T1，表明功能菌的應用能夠提高辣椒的株高和莖粗；T2與T1之間具有顯著性差異，表明微量元素的添加也能夠提高辣椒的株高和莖粗。在SPAD值方面，5個噴施肥料處理與CK之間均存在顯著性差異，且噴施復合微生物液體肥料處理效果最優(T4>T3>T2>T1)。在葉片數方面，5個噴施肥料處理與CK之間均存在顯著性差異，同時T4顯著優于T1、CF和CK。在地上部鮮物質量和干物質量方面，T4處理顯著優于其他處理，同時T3與T1、T2與T1間均具有顯著性差異，表明功能菌和微量元素的應用能夠提高辣椒地上部鮮物質量和干物質量，兩者結合后效果更優。在地下部鮮物質量方面，CF、T1、T2、T3、T4處理間均沒有顯著性差異，但均與CK處理存在顯著性差異；在地下部干物質量方面，T4顯著優于T1、CF 和CK，且無論鮮物質量還是干物質量，T4處理均為最高，表明復合微生物肥料的施用同樣能夠促進地下部的生長。

表1 不同處理對辣椒生物學性狀的影響

注：表中數據表示平均值±標準偏差。同列數據小寫字母不同表示處理間差異達到<0.05顯著水平，下表同。

2.2 噴施不同肥料對白菜生物學性狀的影響

不同處理對白菜生物學性狀的影響如表2所示。在株高、葉長和葉綠素SPAD值方面，T4處理與T2處理間無顯著性差異，但均顯著優于T3、T1、CF 和CK，表明微量元素的添加能夠促進白菜的株高、葉長和葉綠素含量，其中T4處理要優于T2處理，表明功能菌同樣起到了促生作用。在葉片數和葉寬方面，T4、T3、T2和T1之間均無顯著性差異，但均顯著優于CK，且T4>T3> T2> T1。在地上部鮮物質量和干物質量方面，T4>T3> T2> T1>CF>CK，且T4顯著優于除T2外其他處理和對照，表明功能菌和微量元素的添加均起到了促生效果。在地下部鮮物質量方面，CF、T1、T2、T3和 T4處理間均沒有顯著性差異，但均與CK處理存在顯著性差異。在地下部干物質量方面，T4、T3、T2、T1、CF、CK之間均無顯著性差異，但T4、T2和T1顯著優于CK。

表2 不同處理對白菜生物學性狀的影響

2.3 不同處理對辣椒和白菜葉際中芽孢桿菌數量的影響

不同處理對辣椒葉際中芽孢桿菌數量的影響如圖1A 所示，T3和 T4處理間無顯著性差異，但顯著高于 T1、T2、CF、CK 處理；T1與 T2和 CK 處理間均無顯著性差異，但顯著高于 CF 處理，且 T2、CF 和 CK 間無顯著性差異。

2.4 不同處理對辣椒葉際中可培養微生物數量的影響

不同處理對辣椒葉際中可培養細菌數量的影響如圖2A所示，T4和T3處理間無顯著性差異，但顯著高于其他處理；T1和T2處理均與CK存在顯著性差異，但T1、T2和CF處理間無顯著性差異；CF 和CK間無顯著性差異。不同處理對辣椒葉際中可培養真菌數量的影響如圖2B所示，CK與CF處理間無顯著性差異，但高于其他處理；CF、T1、T2和T3處理間無顯著性差異。

不同處理對白菜葉際中芽孢桿菌數量的影響如圖1B所示，T3和 T4處理間無顯著性差異，但顯著高于T2、T1、CF和CK，且 T1、T2、CF、CK 處理間無顯著性差異。

結果表明，含SQR9 復合微生物液體肥料能夠提高辣椒和白菜葉際中芽孢桿菌的數量(T3和 T4處理)，且含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素+SQR9 的復合微生物液體肥料的效果最佳，推測SQR9 在辣椒和白菜葉際得到了有效定殖。

(圖中小寫字母不同表示處理間差異達到P<0.05顯著水平，下圖同)

(A：細菌數量，B：真菌數量)

2.5 不同處理對白菜葉際中可培養微生物數量的影響

不同處理對白菜葉際中可培養細菌數量的影響如圖3A所示，T3和T4處理間無顯著性差異，但顯著高于T2、CF 和CK處理；T1、T2和CF處理間無顯著性差異；T1顯著高于CK。不同處理對白菜葉際中可培養真菌數量的影響如圖3B所示，CK和CF高于T1、T2、T3和T4處理，且CK與各施有機肥處理間具有顯著性差異。

(A：細菌數量，B：真菌數量)

3 討論

辣椒和白菜的盆栽試驗結果表明，綜合各項指標，添加了功能菌的水溶肥料的效果均要優于未添加的，功能菌SQR9 促進植物生長的效果已經在多種作物上被證明[27-28]，本研究進一步表明葉面噴施 SQR9 菌株同樣能夠有效促進植物的生長，研究結果能夠為根際有益菌應用范圍的拓寬提供依據。添加了微量元素的水溶肥料同樣體現出優異的促生作用，微量元素是作物體內很多化學反應中所必需酶或輔酶的重要組成部分，對植物的生長發育起著至關重要的作用[29]，劉廣富等[30]的研究同樣表明，在辣椒種植過程中添加微量元素肥料能夠有效提高辣椒生物學性狀、產量和品質。同時添加了氨基酸、微量元素和功能菌SQR9 的T4處理比其他處理(CF、T1、T2、T3)和對照(CK)更要優異，其更能夠促進辣椒和白菜的生長，提高辣椒和白菜的生物學性狀，推斷是氨基酸、微量元素和功能菌株的協同作用，氨基酸同樣已經被廣泛證明能夠有效促進植物的生長[31-32]，王蓓等[33]研究表明，在辣椒和豇豆葉面噴施氨基酸水溶肥料能有效提高它們的產量，本研究進一步證實了聯合多種促生因子，能夠進一步提高葉面水溶肥的促生效果，為高效葉面水溶肥的開發提供了依據。

對辣椒和白菜葉際中芽孢桿菌的數量測定結果表明，含SQR9水溶肥料(T3和 T4處理)噴施到辣椒和白菜葉部后，提高了辣椒和白菜葉際中芽孢桿菌的數量，推測增加的芽孢桿菌中含有試驗添加的SQR9。謝蘭芬等[34]研究表明，在玉米葉片上噴霧解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2 菌液后，能夠在玉米葉片上檢測到該菌株，說明解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2 能夠在玉米葉際有效定殖。因此，根據葉際芽孢桿菌數量增加，表明功能菌在葉際的有效定殖是新型水溶肥葉際發揮作用的重要原因。

植物的葉、莖、花、果等地上有效部分組成的生境統稱為葉際，生存在其表面和內部的大量的各種類型的微生物稱為葉際微生物[35]，它們發揮著重要的生態功能，能改變宿主微環境、防御病害、促進生長、降解有害污染物和固氮[36-39]等。本研究在獲得促生效應的同時，初步研究了葉面噴施含SQR9復合微生物液體肥料對辣椒和白菜葉際可培養微生物數量的影響。結果表明，噴施該肥料能顯著提高辣椒和白菜葉際中細菌的數量，降低真菌的數量。有大量研究表明，細菌生物有機肥施用后能促進根際土壤中細菌和放線菌的增殖，降低真菌數量，進而改善微生物群落結構[21, 41-42]。因此，初步推測含SQR9復合微生物液體肥料的施用，同樣能夠改善葉際微生物群落結構，改善微生物環境。

綜上，葉面噴施以解淀粉芽孢桿菌SQR9 為目標菌株，酸解廢棄豬毛所制成的氨基酸為主要原料、并鰲合一定量的微量元素、配比一定量的養分和糖蜜研制成的復合微生物液體肥料可有效促進辣椒和白菜的生長，改變辣椒和白菜葉際微生物組成。

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Foliar Spraying of Liquid Compound Microbial FertilizerContainingSQR9 Promoted Plant Growth

LU Yunfeng1, XU Hang1, DUAN Huatai1, MEI Xinlan1, LI Rong1*, GUAN Xiaojin2*, ZHANG Nan1, SHEN Qirong1

(1 Jiangsu Key Laboratory of Solid Organic Waste Utilization/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization / National Engineering Research Center for Organic-based Fertilizer / College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment, Nanjing 210042, China)

This research aims to study the effects of foliar spraying of compound microbial liquid fertilizer containingSQR9 on the plant growth for developing a novel application mode of plant growth-promoting rhizobacteria and a novel foliage liquid fertilizer. Pepper and cabbage were selected as the tested model crops, and pot experiments were performed containing 6 treatments: spraying with water (CK), water soluble chemical fertilizer (CF), water soluble fertilizer containing chemical fertilizer, amino acids, and molasses (T1), water soluble fertilizer containing chemical fertilizer, amino acids, molasses, and microelement (T2), water soluble fertilizer containing chemical fertilizer, amino acids, molasses, and strain SQR9(T3), liquid compound microbial fertilizer containing chemical fertilizer, amino acids, molasses, microelement, and strain SQR9(T4). Pot experiment results showed that compared to the other five treatments (CK, CF, T1, T2, T3), T4treatment efficiently promoted pepper and cabbage growth by improving their biological characters; and the results from the number of cultural microbes showed that compared to CK and CF, the other four treatments (T1, T2, T3, T4), after application of strain SQR9 containing fertilizers effectively enhanced the number ofand led to greater impact on the culturable microbial population in pepper and cabbage phyllosphere with the greatest influence for T4treatment. In conclusion, the liquid compound microbial fertilizer containingSQR9 can effectively promote the growth of pepper and cabbage by foliar spraying.

SQR9; Microelement; Foliar spraying; Pepper; Cabbage; Compound microbial liquid fertilizer

國家重點研發計劃項目(2017YFD0200805、2016YFD0800605)、江蘇高校品牌專業建設工程資助項目(PPZY2015A061)和校大學生創新訓練項目(1713A24)資助。

lirong@njau.edu.cn; guanxiaojin@ofdc.org.cn)

盧云峰(1992—)，男，云南大理人，碩士研究生，主要從事土壤微生物與生物肥料研究。E-mail: 2284932093@qq.com

S144.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.05.009