黃芪甲苷對CCL4所致肝損傷大鼠的保護作用*

徐 飛，李偉榮

近年來，臨床廣泛開展的中藥抗肝損傷的實驗研究為臨床治療提供了許多新思路[1-3]。現(xiàn)已證實許多中藥，如莪術(shù)散、復(fù)元活血湯、丹參飲等對肝臟具有很好的抗損傷和保護作用[4]。黃芪為豆科植物內(nèi)蒙黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫、脫毒生肌等功效[5]。黃芪甲苷作為黃芪的主要成分，能通過各種信號通路，發(fā)揮抗糖尿病、抗纖維化、抗炎、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)和心臟保護等多種功效[6]。大量研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷對于糖尿病、心血管疾病和惡性腫瘤等多種疾病均有很好的療效，但是在國內(nèi)外黃芪甲苷的護肝作用研究還鮮見報道[7]。本研究采用CCL4建立大鼠肝損傷模型，予以不同劑量的黃芪甲苷干預(yù)，觀察了黃芪甲苷對肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑與儀器 健康成年雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量為（220±20）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號【SCXK（京）2017-0022】。飼養(yǎng)條件符合清潔級標(biāo)準(zhǔn)。黃芪甲苷購于上海阿拉丁試劑有限公司（純度≥98%），CCl4（分析純）購于汕頭市西隴化工有限公司，檢測超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，檢測血生化和羥脯氨酸（Hyp）試劑盒均購于上海科華生物工程股份有限公司，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）染色試劑盒購于瑞士羅氏公司。Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀購于美國Biotek公司，倒置熒光顯微鏡購于德國ZEISS公司，石蠟包埋機購于日本Tissue-TEK公司，自動生化分析儀購于日本日立公司，紫外可見分光光度計購于上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 肝損傷模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1 w，隨機將其分為對照組、模型組和小、中、大劑量黃芪甲苷處理組，每組10只。參照文獻行肝損傷大鼠模型制備[8]。在模型組和黃芪甲苷處理組，均給予40%CCL4玉米油溶液1.5 ml·kg-1靜脈注射，給予對照組大鼠靜脈注射等量生理鹽水，各組大鼠均每3 d注射一次。分別給予小、中、大劑量組大鼠黃芪甲苷40 mg·kg-1、80 mg·kg-1和160 mg·kg-1灌胃，在對照組，給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)40 d后，稱量大鼠體質(zhì)量，經(jīng)眼眶取血，經(jīng)離心分離血清。取肝組織，置入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)行病理學(xué)檢查；另取肝組織，經(jīng)研磨、勻漿。

1.3 檢測指標(biāo) 包括肝組織勻漿SOD、GSH和MDA含量、血生化和血清Hyp含量。

1.4 肝細胞凋亡檢測 采用TUNEL法，取石蠟切片，按照TUNEL檢測試劑盒說明書操作，每組隨機選擇5個視野，計數(shù)凋亡小體，取均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，采用one-way ANOVA檢驗，對方差齊性者，采用LSD分析，對方差不齊者，采用Games-Howell檢驗。應(yīng)用Graphpad Prism 5.0軟件繪圖，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織勻漿SOD、MDA和GSH水平比較 模型組大鼠SOD含量顯著低于對照組（P＜0.05），而小、中、大劑量黃芪甲苷處理組大鼠血清SOD含量均顯著高于模型組（P＜0.05）；模型組大鼠MDA含量顯著高于對照組（P＜0.05），而小、中、大劑量黃芪甲苷處理組大鼠MDA含量均顯著低于模型組（P＜0.05）；模型組大鼠GSH含量顯著低于對照組（P＜0.05），而小、中、大劑量黃芪甲苷處理組大鼠GSH含量均顯著高于模型組（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠肝組織勻漿SOD、GSH和MDA（±s）比較

表1 各組大鼠肝組織勻漿SOD、GSH和MDA（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

SOD（U/mg） GSH（U/mg） MDA（U/mg）對照組 10 100.15±8.81 20.84±0.83 8.06±1.52模型組 10 67.47±7.34① 9.03±0.75① 20.88±1.05①小劑量黃芪 10 72.36±7.25② 23.39±0.71② 18.46±0.85②中劑量黃芪 10 79.36±7.36② 25.52±1.23② 15.29±0.93②大劑量黃芪 10 89.25±7.14② 27.67±1.38② 11.47±2.05②只

2.2 各組大鼠血生化指標(biāo)比較 見表2。

表2 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）比較

表2 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） ALB（g/L）對照組 10 33.25±12.32 103.25±14.25 13.72±3.09 38.42±4.75模型組 10 86.52±21.23① 216.33±45.21① 31.23±2.10① 34.52±3.10①小劑量黃芪 10 49.36±10.34② 141.25±45.33② 25.92±2.10② 38.51±1.20②中劑量黃芪 10 41.36±11.42② 115.17±26.15② 23.83±3.11② 38.56±2.03②大劑量黃芪 10 39.65±17.25② 99.56±15.14② 23.65±2.13② 38.12±2.03②

2.3 各組大鼠血清Hyp含量比較 小、中、大劑量黃芪甲苷處理組大鼠血清Hyp含量分別為（20.1±3.05）μg/g、（19.36±5.14）μg/g和（19.16±3.13）μg/g，均顯著低于模型組[（27.83±2.56）μg/g，P＜0.05]，而與對照組比無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠肝組織病理學(xué)改變情況 模型組大鼠肝組織細胞索紊亂、細胞水樣變性、炎癥細胞浸潤；與模型組比，黃芪甲苷處理組大鼠肝組織損傷改善（圖1）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（H&E，200×）

2.5 各組大鼠肝組織細胞凋亡情況 對照組大鼠肝組織切片中幾乎不可觀察到凋亡小體，其相應(yīng)凋亡小體個數(shù)為（17.23±3.08）個；相比較于對照組，模型組大鼠肝組織切片中凋亡小體顯著增多，其凋亡小體個數(shù)為（66.54±2.56）個；黃芪甲苷低、中及高劑量組大鼠凋亡小體個數(shù)均顯著低于模型組（P＜0.05，圖2A和2B）。

圖2 各組大鼠肝組織細胞凋亡情況

3 討論

當(dāng)CCL4進入機體后被肝臟微粒色素P450激活，形成的三氯甲基和氯自由基能與肝細胞溶酶體、微粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用，從而導(dǎo)致肝損傷[9，10]，本研究在模型組大鼠血清ALT和AST顯著升高，肝組織學(xué)表現(xiàn)為肝損傷，證實肝損傷模型制備成功。黃芪甲苷處理組大鼠血清ALT和AST水平顯著降低，肝組織學(xué)損傷改善。

在CCL4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠，模型組大鼠血清白蛋白水平明顯低于對照組，這是因為在肝損傷時，白蛋白的合成、細胞內(nèi)運輸和釋放均發(fā)生障礙，引起血清蛋白減少[12]。相比于模型組，黃芪甲苷處理組大鼠血清白蛋白水平顯著升高，說明黃芪甲苷能有效調(diào)節(jié)肝損傷大鼠蛋白合成功能。肝細胞受損后其攝取、結(jié)合膽紅素的能力及毛細膽管排泄膽紅素的能力下降，導(dǎo)致血清膽紅素水平升高[13]。因此，膽紅素水平可以作為反映肝臟生化功能的指標(biāo)之一，可用于判定肝臟損傷程度。有研究表明，機體正常生理濃度的膽紅素具有很好的抗氧化作用，可有效從多方面保護細胞受損[14，15]。研究證實，在肝損傷狀態(tài)下膽紅素在體內(nèi)積蓄，而失去抗氧化作用，且隨著血清膽紅素水平的升高，肝臟損傷程度變得嚴重。在本研究，經(jīng)黃芪甲苷處理的大鼠血清膽紅素水平顯著降低，說明黃芪甲苷能在一定程度上促進肝細胞對膽紅素的代謝，在一定程度上減輕了肝損害的不利因素。Hyp既是膠原蛋白形成的主要成分，也是判斷肝損傷及早期肝纖維化的重要指標(biāo)。在黃芪甲苷干預(yù)后，給藥組大鼠血清Hyp含量顯著降低，也說明黃芪甲苷能通過降低肝組織Hyp含量實現(xiàn)對肝損傷的保護作用。

肝損傷往往伴隨著脂質(zhì)過氧化過程的發(fā)生，相應(yīng)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如活性氧自由基和MDA等也會增加，其中MDA含量常被用于評價脂質(zhì)過氧化程度，也可以間接地作為細胞氧化損傷的評價指標(biāo)[16]。SOD活力維持在正常水平是保護肝臟功能所必須的，對預(yù)防、修復(fù)氧化應(yīng)激引起的肝損傷具有重要的作用，SOD活力能反映機體清除活性氧自由基的能力[17]。GSH是一種低分子自由基清除劑，可清除O2、H2O2、LOOH，是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物，并且是谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶兩種酶類的底物，為兩種酶分解過氧化物所必須的原料[18]。因此，肝組織GSH含量在一定程度上可用于評價肝損傷受到氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷的程度[19]。MDA、SOD和GSH三項指標(biāo)的測定常相互配合，用于評價機體氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)急系統(tǒng)平衡，或這種平衡造成的氧化損傷狀態(tài)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用黃芪甲苷能有效提升CCL4致肝損傷大鼠肝組織GSH和SOD活性，減少MDA的生成，證實黃芪甲苷能有效改善肝組織的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化損傷的程度。

病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，肝損傷大鼠肝組織可見明顯的細胞索紊亂、細胞水樣變性、炎癥細胞浸潤，在予以大鼠黃芪甲苷干預(yù)后，給藥組大鼠的上述病理學(xué)表現(xiàn)得到明顯改善。在小鼠體內(nèi)實驗也證實黃芪甲苷對肝損傷具有很好的改善作用[21]，與本研究結(jié)果一致。經(jīng)TUNEL染色發(fā)現(xiàn)肝損傷會引起肝組織細胞發(fā)生明顯的凋亡，而給藥組大鼠肝組織細胞凋亡數(shù)明顯低于模型組，說明黃芪甲苷對肝損傷所致的細胞凋亡有一定的抑制作用。