人臍帶間充質干細胞移植對酒精性肝損傷大鼠的保護作用*

高 磊，曹 蕾，王瑞芳，馮丹丹，薛 娟

人臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）數量豐富，在組織工程和細胞治療領域具有很大的應用價值[1]。近年來，研究發現人UCMSCs具有免疫調節和分化為肝細胞的能力，在治療肝臟疾病方面有顯著的療效[2-4]。酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是臨床普遍存在的一種慢性酒精中毒引起的酒精性肝病。甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）是中草藥甘草的主要有效成分，具有抗炎、加強肝臟的解毒功能和減輕肝細胞的損傷作用，在肝病治療領域被廣泛應用[5]。本文采用人UCMSCs移植和甘草酸處理ALD大鼠，觀察了其對酒精性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、藥物與儀器 40只健康SD大鼠，體質量為（110±20）g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗技術有限公司【許可證號SCXK（京）2011-0011】。Ⅱ型膠原酶（Sigma，美國）；D-Hank’s液、胎牛血清、DMEM/F12培養基、0.25%胰蛋白酶、Mesen PRO RSTMMedium（Gibico，美國）；市售 56?紅星二鍋頭；檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木精-伊紅染色液（北京索萊寶）；TransScript One-Step cDNA 合成試劑盒和Tap PCR Mix（北京全式金生物技術有限公司）；CYP2B1引物設計及合成（金斯瑞生物科技公司）。GL為本實驗室自制。光學顯微鏡（Olympus，日本）；低溫高速離心機（Thermo，美國）；PCR 分析儀（ABI，美國）；酶標儀（Bio Tek，美國）；恒溫震蕩儀（其林貝爾儀器設備有限公司）；6孔板、培養瓶、培養皿（Coming，美國）。

1.2 UCMSCs培養[6]本研究經醫院醫學倫理委員會批準。經過產婦知情同意后，采集正常足月剖宮產健康胎兒臍帶組織，置入Hank’s液，4℃保存。在超凈臺內取出臍帶，用PBS沖洗血液，用手術刀剔除臍帶內血管，將臍帶剪成1～2 mm3組織塊，放入培養瓶，加入Ⅱ型膠原酶消化，過濾、收集細胞，接種在6孔板內，置于CO2培養箱內培養。96 h后半量更換培養液，以后隔半天半量換液，顯微鏡下觀察，大約10 d后，細胞融合達到80%時，進行傳代培養。

1.3 慢性ALD動物模型的建立與細胞移植干預[7]取40只SD大鼠，正常飼養1 w，給予其中30只白酒10 ml·kg-1灌胃，早晚各一次，連續30 d。待大鼠狀態變差，活動減少，精神萎靡，毛發無光澤時，即建立慢性ALD模型成功。將ALD動物隨機分為模型組（B組）、臍帶間充質干細胞移植組（C組）和臍帶間充質干細胞聯合甘草酸處理組（D組）。給予B組動物生理鹽水1 ml，給予C組動物UCMSCs（1×1010/L）1 ml，給予 D 組動物 UCMSCs （1×1010/L）和甘草酸（100 mg·kg-1）1 ml，門靜脈注射，另10只為對照組（A組），給予生理鹽水1 ml門靜脈注射。

1.4 血清檢測 在細胞移植2 w后，經尾靜脈取血，4℃、4000 r/m離心10 min，分離血清，于 -20℃冰箱保存，備測。

1.5 肝組織病理學檢查 取血后，即刻取出肝臟，取部分肝組織用10%甲醛固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.6 肝組織細胞色素P450亞酶（CYP2B1）mRNA水平檢測 采用RT-PCR法，在液氮中研磨肝組織，加入Trizol溶液提取總RNA。應用核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳對提取的RNA進行分析。取總RNA 4μL，82℃水浴5 min，加入反轉錄反應液，44℃孵育60 min，留取產物待用。引物見表1，擴增參數，95℃ 10 min，60℃ 50 s，72℃延伸 50 s，72℃延伸10 min，10℃保存。基因水平分析采用 2-△Ct法，將GAPDH設為內參，取Ct值。計算公式為：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（GAPDH）；△△Ct=△Ct（實驗組）-△Ct（對照組）。

表1 引物序列

1.7 統計學分析 應用SPSS 19.0軟件行統計學處理，計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05判定為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 肝組織病理學變化 A組大鼠肝組織結構完整，肝小葉結構清晰，細胞形態規則，細胞核圓形，胞質豐滿，無異常改變（圖1A）；B組大鼠肝小葉界限不清晰,肝細胞索排列紊亂，細胞核模糊不清，肝細胞胞質內有大小不等的圓形脂肪空泡，部分肝細胞腫脹,可見點灶壞死和部分炎性細胞浸潤（圖1B）；C組和D組肝損傷有不同程度的減輕，以D組減輕較明顯（圖1C、圖1D）。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態學變化（HE,400×）

2.2 UCMSCs形態學觀察結果 體外培養細胞3～5 h，細胞開始貼壁，48 h完全貼壁，出現長梭形和少量成纖維樣細胞。隨著傳代次數的增加，成纖維樣的UCMSCs增殖速度加快，擴增純化后的第3代臍帶間充質干細胞形態似長梭形，呈輻射狀生長（圖2）。

圖2 人臍帶間充質干細胞（200×）

2.3 各組大鼠血清指標水平比較 與A組比，B組大鼠血清AST、ALT和MDA水平顯著升高，而SOD和GPx水平顯著降低；與B組比，C組和D組血清AST、ALT和MDA水平顯著下降（P＜0.05），SOD和GPx水平顯著升高（P＜0.05，表2）。

表2 各組大鼠血清指標（±s）比較

表2 各組大鼠血清指標（±s）比較

與A組比，①P＜0.05；與B組比，②P＜0.05；與C組比，③P＜0.05

只 AST（U/L） ALT（U/L） MDA（μmo/L） SOD（U/L） GPx（U/ml）A 組 10 85.5±12.7 30.8±4.5 0.6±0.1 225.7±16.4 912.3±29.5 B組 10 210.6±26.0① 111.2±13.7① 1.6±0.1① 141.3±6.9① 336.5±26.1①C組 10 106.3±13.6①② 50.6±8.7①② 1.0±0.1①② 173.1±10.4② 668.9±22.4②D 組 10 90.7±6.6②③ 36.2±5.1②③ 0.7±0.1②③ 198.1±12.3②③ 885.2±25.4②③F 130.132 176.440 202.502 90.103 1049.854 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組肝組織CYP2B1 mRNA水平比較 與A組比，B組肝組織CYP2B1 mRNA水平顯著降低；與B組和C組比，D組肝組織CYP2B1 mRNA水平顯著增強，差異有顯著性統計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組肝組織CYP2B1 mRNA水平比較

3 討論

研究指出，酒精中的乙醇在代謝時產生大量的自由基，致使肝細胞膜發生脂質過氧化，能引起肝臟組織中的肝細胞損傷和死亡，導致轉氨酶升高。酒精代謝過程中產生的乙醛會對肝細胞產生毒性作用，抑制谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成，減弱SOD等抗氧化能力，導致大量MDA等氧化物的生成[8，9]。MDA的含量可以反映出機體細胞受自由基攻擊的程度，SOD、GSH的活性高低是反映機體抗氧化能力的指標[10]。ATL和AST存在于肝細胞漿中，當肝細胞受損時，可使血清ATL和AST水平升高，是肝損傷的敏感指標。ATL和AST的大量釋放，會加速SOD、GPx的消耗，引起細胞腫脹，肝功能異常，增強肝組織損傷程度[11，12]。本實驗結果顯示，相對于正常的大鼠，模型組大鼠肝組織受損后血清ALT、AST和MDA水平顯著升高，而血清SOD和GPx水平顯著降低。在臍帶間充質干細胞移植組和臍帶間充質干細胞移植聯合甘草酸處理組大鼠血清ALT、AST和MDA水平均顯著下降，SOD和GPx水平顯著升高。臍帶間充質干細胞移植聯合甘草酸處理組血清ALT、AST和MDA水平下降明顯，SOD和GPx水平進一步增高。

CYP2B亞家族與肝臟藥物代謝的作用有關，CYP2B可以催化底物，具有解毒的作用。CYP2B1蛋白是肝細胞特征性功能蛋白[13]。在本實驗中，與模型組或臍帶間充質干細胞移植組比，臍帶間充質干細胞移植聯合甘草酸處理組動物肝組織肝細胞特征性功能蛋白CYP2B1 mRNA水平顯著增高，差異有統計學意義。

目前，尚缺乏理想的治療ALD的藥物，而甘氨酸是很早就被用于治療肝病的藥物，實驗及臨床研究報道，應用甘氨酸能改善肝組織的病理學損傷，減慢肝細胞壞死的進程，血清ALT水平下降，恢復肝細胞內肝糖元和核酸代謝，促進膽紅素代謝，具有抗病毒、抗炎和抗肝纖維化的作用[14-17]。干細胞移植又是近年來組織工程研究的新領域，兩者的結合將會為肝損傷的治療提供新的方法。研究表明UCMSCs在特定的條件下可以向肝細胞分化，在體外動物實驗發現對肝臟疾病有一定的治療作用，并且由于其取材方便、來源廣、獲得方便，將會成為肝病治療領域里的理想選擇[18-20]。在臨床上，研究也顯示UCMSCs移植能改善肝病患者的肝功能及臨床癥狀，提高患者的生存率。

綜上所述，UCMSCs移植能夠有效地保護酒精所致的肝損傷，與甘氨酸聯合使用后效果更明顯，其機制可能與抗自由基及脂質過氧化有關。