慢性乙型肝炎患者血清IL-12、IL-18水平和外周血單個核細胞FOXp3基因水平研究*

朱凌云，張茂海，崔莎莎，張秋萍

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的以肝實質病變為主的一種傳染病。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）呈全球分布，是一個非常嚴重的公共衛生問題[1，2]。尋找新的治療CHB的靶點是現今急需深入研究的問題。CD4+CD25+調節性 T 細胞 （regulatory T cell，Treg）是一種具有獨特免疫調節功能的T淋巴細胞亞群，具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特性，在維持自身穩定和對外來抗原的免疫耐受過程中扮演著重要的角色[3，4]，也對CHB病程和預后產生影響。叉頭蛋白 P3（forkhead/winged helix transcription factor，Foxp3）是CD4+CD25+Treg細胞生長發育和功能維持的關鍵性調控因子，是Treg細胞表達的特異性免疫標志物，常被用于辨別CD4+CD25+Treg細胞[5]，也被認為是CD4+CD25+Treg細胞發揮功能的主開關[6]。越來越多的研究顯示，其在免疫相關性疾病的發病過程中起作用，如慢性乙型肝炎發病機制可能涉及Treg細胞與效應T細胞之間的免疫失衡，并與HBV感染慢性化有關。白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和IL-18也是近年來研究的熱點。我們檢測了CHB患者外周血單個核細胞Foxp3及血清IL-12和IL-18水平，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年7月～2018年3月期間我院收治的CHB患者78例，男48例，女30例；年齡24～57歲，平均年齡為（39.9±6.2）歲。符合慢性乙型肝炎防治指南的診斷標準[7]，納入患者未接受過免疫調節劑和抗病毒治療。排除標準：合并甲、丙、丁、戊型肝炎，合并嚴重的心肺功能損傷，妊娠或哺乳期婦女，其他原因引起的肝病。另選同期健康體檢者25例，男20例，女5例；年齡25～55歲，平均年齡為（38.2±6.3）歲。本研究已通過我院醫學倫理委員會批準，受檢者簽署知情同意書。

1.2 檢測方法 清晨空腹抽取靜脈血10 mL，加入EDTA抗凝管，置于-70℃冰箱保存待檢。使用淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司）常規分離外周血單個核細胞，以Trizol法常規提取淋巴細胞總 RNA，上游引物和下游引物分別為 5’-TCACCTACGCCACGCTACT-3’和5’-ACTTCAGGG TTGTGGCGATGG-3’，以Foxp3 mRNA特異引物行RT-PCR（美國Fermetas公司）檢測，擴增片段為226 bp，將擴增目的基因在瓊脂糖凝膠上進行電泳，在紫外燈分析儀上觀察結果，以β-actin為內參照，擴增片段為448 bp，以Foxp3/β-actin作為半定量指標。采用ELISA法（羅氏公司）檢測血清IL-12和IL-18水平；使用美國貝克曼庫爾特公司生產的AU5800全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用熒光定量PCR法（湖南圣湘生物科技有限公司）檢測血清HBV DNA水平。

1.3 肝穿刺 患者取仰臥位，右手臂上抬彎曲置于枕后，局部皮膚常規消毒，用2%利多卡因行局部麻醉，逐層穿刺皮膚、肋間肌和肝包膜，快速推動切割式針芯進入肝實質，切割肝組織并快速拔針，無菌紗布覆蓋并固定穿刺部位，多頭腹帶緊束肋部及上腹部，加壓包扎。

1.4 統計學分析 應用SPSS 20.0軟件對數據進行處理分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同肝組織炎癥活動度分級患者血生化指標和HBV DNA水平比較 G4組患者肝功能指標ALT和AST水平顯著高于G1、G2和G3組患者，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 不同肝組織炎癥分級患者血生化和HBV DNA 水平（±s）比較

表1 不同肝組織炎癥分級患者血生化和HBV DNA 水平（±s）比較

與G1組比，①P＜0.05；與G2和G3組比，②P＜0.05

數 ALT（U/L） AST（U/L） HBV DNA（lg copies/ml）G1 組 21 113.2±67.4 73.5±25.3 5.1±0.5 G2組 24 153.6±45.3① 113.8±35.2① 5.3±0.6 G3組 19 240.5±56.6① 156.7±51.2① 5.0±0.8 G4組 14 563.5±132.4①② 513.3±102.5①② 5.2±1.0例

2.2 CHB患者與健康人血清IL-12、IL-18及Foxp3基因水平比較 CHB患者血清 IL-12、IL-18及Foxp3基因水平顯著高于健康人，差異具有統計學意義（P＜0.05，表2）。

表2 兩組血清細胞因子和單個核細胞Foxp3 mRNA水平（±s）比較

表2 兩組血清細胞因子和單個核細胞Foxp3 mRNA水平（±s）比較

數 IL-12（pg/ml） IL-18（pg/ml） Foxp3 mRNA CHB 78 198.3±19.6 408.6±91.2 4.5±0.7健康人 25 64.5±10.9 127.3±15.7 3.3±0.4 t 43.010 26.063 8.139 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001例

2.3 不同肝組織炎癥分級CHB患者血清IL-12、IL-18及Foxp3 mRNA水平的比較 G4組患者血清IL-12、IL-18及Foxp3基因水平顯著高于G1、G2和G3組，差異具有統計學意義（P＜0.05，表3）。

表3 不同炎癥分級CHB患者血清IL-12、IL-18及Foxp3 mRNA 水平（±s）比較

表3 不同炎癥分級CHB患者血清IL-12、IL-18及Foxp3 mRNA 水平（±s）比較

與G1組比，①P＜0.05；與G3組比，②P＜0.05

數 IL-12（pg/ml） IL-18（pg/ml） Foxp3mRNA G1 組 21 146.3±15.2 390.2±90.3 3.7±0.6 G2組 24 185.2±13.6① 403.6±93.2 3.9±0.5 G3組 19 203.2±18.3① 414.3±105.4 4.3±0.7①G4組 14 237.5±23.6①② 431.5±106.3①② 5.1±0.3①②例

3 討論

CHB感染呈全球性分布，我國CHB感染率高達10%以上，CHB可發展成為肝硬化、肝衰竭及肝細胞癌等疾病，嚴重困擾著患者及臨床工作者[8]。CHB會導致患者肝功能受損。本研究中CHB患者肝功能指標AST和ALT顯著高于健康人，差異具有統計學意義，這也提示了CHB對機體損傷的嚴重性。目前，臨床上對于CHB的發病機制研究結果未明確，且臨床抗病毒治療效果較差，其主要原因還是由于抗病毒藥物并不能完全清除HBV DNA，且CHB患者或多或少存在著對HBV不同程度的免疫耐受。免疫耐受是指人體對于外來抗原刺激表現出特異性的免疫不應答，對不引起耐受的其他抗原仍然可以產生很好的免疫應答，這就被稱之為免疫耐受[9，10]。

Sakaguchil第一次通過清除機體自然產生的CD4+CD25+調節性T細胞后發現會導致自身免疫性疾病，而增加該細胞則能夠防止其發生。Tregs是一群擁有負調控作用的T細胞亞群，具有獨特免疫調節功能，能夠抑制機體的免疫反應，對于維持機體免疫穩態、抗腫瘤免疫和移植免疫耐受方面有著決定性的作用，在病毒感染性疾病中，其一方面可以抑制過度免疫病理損傷，另一方面也可能有利于病毒的持續感染，當機體構成免疫耐受時，HBV很難被免疫系統清除，并且促使HBV感染持續向著慢性化發展，相關研究也顯示，CHB患者體內CD4+Tregs明顯增高，并抑制抗病毒免疫應答，提示著Tregs與HBV感染所致的免疫耐受有關，并可能導致HBV感染向慢性化進程發展[11-13]。CD4+CD25+Treg現已成為當今研究自身免疫病的新的靶點之一。

Foxp3是翼狀螺旋轉錄因子超家族成員之一，被認為是調節性T細胞的發展和功能的主要調節因子。在以往研究中，在Foxp3基因缺陷的小鼠中無法檢測到CD4+CD25+Treg，這說明了Foxp3是衡量CD4+CD25+Treg區別于其他CD4+CD25+Treg的特異性標志。Foxp3也可使初生CD4+CD25+T細胞轉化為CD4+CD25+Treg，是在此轉化過程中獲得免疫調節特性的關鍵轉錄調節因子。Foxp3基因定位于Xp11.23，含有84個氨基酸殘基的foxhead結構域，C2H2鋅指結構和一個亮氨酸拉鏈，該基因家族編碼蛋白具有相似的保守結構，均通過其Foxhead結構域與DNA特定位點結合，調節目的基因的活化和表達[14，15]。目前，已在淋巴組織和肝細胞中檢測到其存在，并與肝細胞癌有關，但其作用尚未明確[16]，Foxp3在腫瘤細胞中表達并參與腫瘤行為的調控，Foxp3可通過轉化生長因子-β/smad2/3信號通路抑制肝癌的進展，Foxp3作為一種預后因素和新的靶點，為治療肝癌提供了有用的治療方法[17，18]。

IL-18是機體內一種炎性細胞因子，是由活化巨噬細胞、T細胞、NK細胞等產生，具有多種生物學功能，可以增強NK細胞的細胞毒作用，誘導產生T細胞[19]。IL-18早已被證實其在CHB患者肝臟損傷中發揮著重要的作用且與CHB的疾病進展密切相關[20]。IL-12和IL-18具有相同的抗病毒感染作用，IL-12和IL-18可通過增強CTL和NK細胞的活性以及釋放炎性細胞因子，從而參與機體對HBV的免疫清除過程。IL-12和IL-18可有效判斷CHB患者病情的發展及預后。本研究中CHB患者血清IL-12和IL-18水平顯著高于健康人，差異具有統計學意義，其機制可能是由于Th1/Th2細胞失衡所導致的結果，G4組患者血清IL-12和IL-18水平顯著高于G1、G2、G3組患者，差異具有統計學意義，這也說明了IL-12和IL-18參與了CHB患者肝臟炎性化的過程，且隨著炎性程度的加重，IL-12和IL-18水平也在不斷升高。

本研究結果顯示，CHB患者 PMBC Foxp3 mRNA水平顯著高于健康人，差異具有統計學意義，說明Foxp3 mRNA過度表達所導致的機體免疫應答下降，產生免疫耐受，使HBV不能被快速清除，而導致感染慢性化。慢性乙型肝炎肝組織嚴重炎癥損傷（G4）患者Foxp3 mRNA水平顯著高于其他各組，差異具有統計學意義，說明Foxp3的異常升高可能與慢性乙型肝炎炎性反應程度有關，具體機制可能為慢性乙型肝炎患者炎性反應較為嚴重，使TGF-β含量增高，在外周刺激CD4+CD25+Treg細胞增殖和成熟，誘導Foxp3的表達，導致Foxp3 mRNA水平異常升高。

Foxp3 mRNA的異常升高代表著CD4+CD25+Treg細胞的活性增強，從而抑制了效應T細胞的免疫反應，使機體的免疫應答能力下降，最終導致HBV不能被有效清除而對機體產生持續感染，并使疾病朝著慢性化的方向發展。深入研究PBMC Foxp3-mRNA與IL-12和IL-18等細胞因子的相互作用，對深入研究CHB的發病機制有積極的意義。

綜上所述，血清IL-12和IL-18參與了機體對HBV感染的清除過程，早期檢測體內IL-12、IL-18及Foxp3基因水平有利于對CHB患者病毒復制情況及肝組織炎性程度的有效判斷，對于CHB患者的診斷和治療具有十分重要的意義。由于檢測PBMCs上分子標記物需要高技術支撐和試劑的穩定，本研究結果還需要更多后續研究證據的支持。