IFNL4和IL-28B基因多態性檢測評估慢性乙型肝炎患者抗病毒治療應答價值分析*

張迎明，申 爽，田 飛，孫園園

我國現階段慢性乙型肝炎（CHB）患者約有2000萬[1]。臨床研究發現抗病毒治療的療效可能與多種免疫學應答基因存在關聯，但其具體機制尚未明確[2，3]。干擾素 λ4（IFNL4）由4個內含子和5個外顯子組成，能特異性結合于異二聚體Ⅱ類細胞因子受體，具有調節免疫和抗病毒功能，體外實驗提示其與抗丙型肝炎病毒療效失敗有關[4-6]。白介素-28B（IL-28B）是干擾素Ⅲ家族中的重要成員，對HBV復制存在抑制作用[7，8]。本研究旨在分析外周血IFNL4和IL-28B基因多態性對CHB患者抗病毒治療應答的影響，旨在為臨床制定治療方案提供依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2015年3月～2017年3月我院收治的CHB患者140例，男78例，女62例；年齡27～56歲，平均年齡為（39.64±20.53）歲；體質指數為 18～25 kg/m2，平均為（22.43±1.41） kg/m2。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[9]的標準。入組前6個月內無應用免疫調節劑、抗病毒藥物史；（3）無認知障礙。排除標準：（1）妊娠或哺乳期婦女；（2）肝癌；（3）肝硬化；（4）有冠心病或糖尿病等基礎疾病；（5）酒精性肝病；（6）自身免疫性肝病。本研究方案獲得醫院醫學倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 治療方法 給予所有患者聚乙二醇干擾素α-2a（上海羅氏制藥有限公司，國藥準字：J20120074）180 μg皮下注射，1 次 /w，治療觀察 12個月。參照《慢性乙型肝炎防治指南》的評估標準，以血清HBV DNA定量低于最低檢測限，血清ALT正常視為應答，否則視為未應答。

1.3 血清檢測 使用貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用熒光定量PCR法測定血清HBV DNA（上海恪敏生物）。

1.4 外周血IFNL4和IL-28B基因多態性檢測 采用DNA提取試劑盒提取血DNA：（1）取血300 μl，置于離心管內，加入細胞裂解液 600 μl，混勻，10000 r/m離心60 s，分離血清。取緩沖液GS 200 μl，置于細胞核沉淀物內，混勻；（2）加入K溶液20 μl，混勻；（3） 加入緩沖液 GB 200 μl，混勻，于56℃條件下反應10 min，混勻，直至溶液呈現為清亮色；（4）加入無水乙醇 200 μl，混勻，將所得絮狀沉淀物和溶液置于收集管內（內置吸附柱CB3），12000 r/m 離心 30 s，棄廢液；（5）取漂洗液PW 600 μl，倒入吸附柱CB3內，12000 r/m離心30 s，棄廢液；（6）重復上述步驟；（7）12000 r/m 離心120 s，棄廢液，于室溫下反應10 min，晾干殘留漂洗液；（8）加入洗脫緩沖液 TB 200 μl，在室溫下反應 5 min，12000 r/m離心 120 s，存放于-20℃冰箱內待測。電泳驗證：（1）將齒梳置于膠膜中，倒入瓊脂糖凝膠液，待厚度達5 mm時停止；（2）在室溫下反應30 min，經凝膠固定，將齒梳拔出，取凝膠置于電泳槽內；（3）加緩沖液，直至沒過膠板；（4）取 DNA 樣品 5 μl，倒入樣孔；（5）電泳 1 h，經化學發光成像系統處理。IL-28B基因分型：經SNaPshot技術對其基因多態性進行測定，選取rsrs8099917位點基因進行分析。反應條件：95℃5 min（95℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 60 s，35 個循環），72℃ 10 min。按照凝膠電泳分析結果將其分成TT型和TG型；IFNL4基因分型：選取rs368234815位點基因進行分析。反應條件：95℃10 min（95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 30 s，35 個循環），72℃ 10 min。按照凝膠電泳分析結果將其分成TT/TT型和TT/△G型。

1.5 統計學方法 應用SPSS 22.0統計學軟件處理數據，計數資料用百分比（%）表示，采用x2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同應答的CHB患者血IFNL4和IL-28B基因多態性比較 在12個月治療結束時，在140例CHB患者中，108例（77.1%）獲得應答，32例（22.9%）無應答。CHB患者IFNL4rs368234815位點基因以TT/TT為主，IL-28Brs8099917位點基因以TT為主。應答組IL-28Brs8099917位點基因TT型占比顯著高于無應答組（P＜0.05），兩組IFNL4基因型比較無顯著差異（P＞0.05，表1）。

2.2 應答與無應答組患者血清肝功能指標和HBV DNA水平比較 治療前，兩組各指標比較無顯著差異（P＞0.05）；治療結束時，應答組患者血清ALT、AST和HBV DNA水平顯著低于無應答組，差異顯著（P＜0.05，表2）。

表1 應答與未應答CHB患者血IFNL4和IL-28B基因多態性[n（%）]比較

表2 應答與無應答組血生化和HBV DNA水平（±s）比較

與未應答組比，①P＜0.05

例數應答組 治療前 108 91.2±4.2 93.1±3.0 13.6±1.4 6.1±3.1治療后 35.4±3.2① 38.6±2.1① 16.2±1.5 3.8±2.1①ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBV DNA（lg copies/ml）未應答組 治療前 32 81.3±4.1 95.0±3.0 16.5±1.3 6.4±3.0治療后 61.5±4.8 73.5±3.0 13.6±1.2 5.2±3.1

2.3 不同IFNL4基因型患者血生化和HBV DNA水平比較 治療結束時，IFNL4 TT/TT型與TT/△G型CHB患者肝功能指標和HBV DNA水平比較，無統計學差異（P＞0.05，表3）。

表3 不同IFNL4基因型CHB患者血生化和病毒學指標（±s）比較

表3 不同IFNL4基因型CHB患者血生化和病毒學指標（±s）比較

基因分型 例數TT/TT 125 47.1±2.5 49.1±1.6 15.5±1.3 4.5±1.2 TT/△G 15 48.0±2.1 59.4±1.5 15.9±1.1 4.7±1.3 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBV DNA（lg copies/ml）1.338 0.690 1.143 0.605 P 0.183 0.491 0.255 0.546 t

2.4 不同IL-28B基因型患者血生化和HBV DNA水平比較 IL-28B TT型感染患者血清ALT、AST和HBV DNA水平顯著低于TG型（P＜0.05，表4）。

表4 不同IL-28B基因型感染者血生化和病毒學指標（±s）比較

表4 不同IL-28B基因型感染者血生化和病毒學指標（±s）比較

基因分型 例數TT 118 36.4±2.1 38.9±2.7 16.8±1.2 4.0±1.7 TG 22 59.0±1.4 72.1±1.1 17.1±1.0 6.0±2.1 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBV DNA（lg copies/ml）5.572 5.462 4.777 4.875 P 0.000 0.000 0.000 0.000 t

3 討論

近年來，有研究指出抗病毒療效可能與免疫學基因多態性有關。若患者攜帶優勢基因，則可提高病毒清除率，改善治療效果[10-12]。IFNL4基因是近年來新發現的基因。在攜帶IFNL4△G基因者，細胞可分泌IFN-γ4蛋白，但分泌能力并不強。一旦出現病毒感染，可能觸發肝組織內IFN-γ4蛋白的弱表達，無法對感染進行有效的抑制[13-16]。IL-28B基因是IFN-γ家族的一員，國外研究發現該基因附近部分位點與抗病毒清除能力存在關聯[17-19]。

本研究以CHB患者為研究對象，并選取IFNL4和IL-28B基因多態性進行分析，結果發現在這兩種基因中，CHB患者主要攜帶IFNL4rs368234815位點的TT/TT型基因和IL-28Brs8099917位點的TT型基因。通過觀察應答組和無應答組人群基因分型差異，發現攜帶IL-28B rs8099917TT基因的患者應答率較高，提示該基因型有利于提高HBV清除率。有學者在丙型肝炎患者的研究中發現，攜帶rs8099917 G/T和G/G基因者抗病毒失敗率顯著高于攜帶TT型的患者[20]。另有研究提示在IL-28B基因中，與抗病毒療效相關的基因多態性有7個，其中rs8099917位點的相關性最強。上述研究均為本研究結論提供了理論依據，支持該位點TT基因與抗病毒療效有關的論點。

本研究提示應答組和無應答組患者血IFNL4基因多態性比較無顯著性差異，表明該基因多態性可能與抗病毒療效無明顯關聯。但有學者認為該基因中攜帶TT/TT型患者應答率高于攜帶TT/△G型患者，與本研究結論相悖。其原因還需要認真尋找。血清HBV DNA水平是診斷HBV感染的靈敏度和特異度最高的指標。研究發現IFNL4的TT/TT和TT/△G基因與患者肝功能和HBV DNA水平無明顯關聯，而IL-28B的TT和TG基因可能與之有關，需進一步研究攜帶IL-28B rs8099917位點TT型基因感染者對抗病毒療效是否真的好。

綜上所述，檢測外周血IL-28B rs8099917位點TT型基因可用于預估CHB患者抗病毒療效，不同基因型感染者可能在血清生化學和病毒學指標方面存在差異，從而篩選出可能獲得更高抗病毒治療效果的人群，而給予針對性的治療。