慢性丙型肝炎和丙型肝炎肝硬化患者外周血Treg和Th17水平變化臨床意義探討*

楊才勇，陳 娜，李 奎，江自成，卜蓉蓉

研究指出[1-3]，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞在各種病毒性肝炎的發(fā)病和病情進(jìn)展過程中均發(fā)揮重要的作用。Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞分別發(fā)揮抗炎和促炎作用，Treg/Th17比值失衡可能是造成肝臟免疫損傷性炎癥或促進(jìn)病毒感染慢性化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[4]。本研究檢測(cè)了慢性丙型肝炎（CHC）和丙型肝炎肝硬化患者外周血Treg和Th17細(xì)胞比例的變化，并分析了其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年3月～2019年1月我院收治的CHC患者31例，男性15例，女性16例；平均年齡為（38.12±6.63）歲。丙型肝炎肝硬化患者35例，男性17例，女性18例；平均年齡為（45.32±9.25）歲。診斷符合《丙型肝炎防治指南》[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，血清抗-HCV和HCV RNA陽性，入組前未曾接受抗病毒和護(hù)肝治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入組前3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用過免疫抑制劑者；（2）伴自身免疫性、藥物性、酒精性肝病或其他病原體感染者；（3）伴原發(fā)性肝癌者；（4）伴巨細(xì)胞病毒或HIV感染者；（5）有癲癇、精神疾病史者；（6）失代償期肝硬化者；（7）基線血清Cr水平大于1.5倍正常值上限、血小板＜90×109/L、中性粒細(xì)胞＜1.5×109/L或男性血紅蛋白低于正常下限者。另選同期來院行健康體檢者66例作為對(duì)照組，男39例，女27例；年齡33～62歲，平均年齡為（43.01±8.58）歲。受試者簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 血清細(xì)胞因子水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-17和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）。

1.3 外周血Treg和Th17細(xì)胞檢測(cè) 抽取空腹靜脈血6 ml，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×106/ml。取PBMC懸液2 ml，加至6孔板內(nèi)，再加25ng/ml佛波酯、1 μg/ml離子霉素、1.7 μg/ml莫能菌素，置于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)5 h。收集細(xì)胞，分為測(cè)定管和對(duì)照管，各100 μl。加抗 CD3-PC5 10 μl、抗CD8-PE單克隆抗體20 μl，室溫、避光孵育15 min。加固定液100μl，室溫、避光反應(yīng)15 min。加PBS 3 ml，混勻離心，棄去上清液。加破膜液100 μl。在2管，均加 IL-17A-FITC 20 μl。室溫/避光孵育20 min，加 PBS 3 ml，靜置10 min。離心、棄去上清液，加PBS 0.5 ml重懸，上流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman）檢測(cè)。根據(jù)CD3和CD8圈定T淋巴細(xì)胞群，測(cè)定Th17細(xì)胞（CD3+CD8-IL-17+T）。取靜脈血100 μl，加抗CD127-PE 單克隆抗體20 μl、抗CD4-FITC單克隆抗體20 μl、抗CD25-PC5單克隆抗體10 μl。混勻，避光孵育20 min。加紅細(xì)胞裂解液2 ml，混勻，避光孵育20 min。加PBS溶液3 ml，洗滌，加PBS 0.5 ml重懸，上機(jī)測(cè)定 Treg細(xì)胞（CD4+CD25highCD127lowT）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；另繪制ROC曲線觀察各指標(biāo)對(duì)肝硬化的預(yù)測(cè)價(jià)值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組人群血清細(xì)胞因子水平比較 丙型肝炎肝硬化患者血清IL-6、IL-17和TGF-β水平顯著高于健康人或CHC患者（P＜0.05，表1）；繪制 ROC 曲線，結(jié)果提示血清高水平的TGF-β能預(yù)測(cè)肝硬化的發(fā)生（AUC=0.963，P=0.000），而血清 IL-6和IL-17預(yù)測(cè)的AUC則分別為0.267和0.624，P=0.470，P=0.057（圖1）。

表1 三組血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

表1 三組血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

與健康人比，①P＜0.05；與丙型肝炎比，②P＜0.05

例數(shù) IL-6（ng/L） IL-17（ng/L） TGF-β（ng/L）丙型肝炎 35 7.20±2.49① 14.12±3.87① 4.41±1.20肝硬化 31 8.08±2.71①② 17.01±4.55①② 5.20±1.35①②健康人 66 6.64±2.33 12.76±3.46 4.19±1.07

圖1 血清TGF-β、IL-6和IL-17預(yù)測(cè)肝硬化的ROC曲線

2.2 三組人群外周血Treg和Th17細(xì)胞比率比較 肝硬化患者外周血Treg細(xì)胞顯著高于，而Th17/Treg比值顯著低于CHC或健康人（P＜0.05，表2）。ROC曲線分析顯示外周血Treg細(xì)胞比率或Th17/Treg細(xì)胞比值可有效預(yù)測(cè)肝硬化【AUC=0.820和AUC=0.607，P=0.000，P=0.041，圖2】，而 TH17 細(xì)胞對(duì)肝硬化無預(yù)測(cè)價(jià)值。

表2 三組人群外周血Treg和Th17細(xì)胞（±s）的比較

表2 三組人群外周血Treg和Th17細(xì)胞（±s）的比較

與其他兩組比，①P＜0.05

例數(shù) Treg細(xì)胞（%） Th17細(xì)胞（%） Th17/Treg比值肝硬化 35 6.27±1.02① 1.22±0.27 0.19±0.05①丙型肝炎 31 5.75±0.84 1.35±0.32 0.23±0.06健康人 66 5.37±0.99 1.16±0.24 0.22±0.05

圖2 外周血Treg、TH17細(xì)胞和Th17/Treg細(xì)胞比值預(yù)測(cè)肝硬化的ROC曲線

3 討論

近年來，一類不同于Th1和Th2細(xì)胞的Th細(xì)胞引起臨床關(guān)注，由于其主要分泌IL-17，故命名為Th17[6]。Th17與多種疾病的炎癥和免疫過程的關(guān)聯(lián)受到學(xué)界的重視。已有證據(jù)表明[7，8]，Th17細(xì)胞在炎癥介導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的作用，Treg細(xì)胞則是免疫抑制細(xì)胞，Th17/Treg比值失衡被認(rèn)為是HCV感染慢性化的關(guān)鍵機(jī)制。

在本研究中，慢性丙型肝炎外周血Th17細(xì)胞比率和血清IL-17水平分別為（1.35±0.32）%和（17.01±4.55） ng/L，均較健康人的（1.16±0.24） %和（12.76±3.46） ng/L 明顯升高，血清 IL-6、IL-17和TGF-β異常升高可能提示HCV感染已經(jīng)進(jìn)入慢性階段，異常升高的TGF-β水平可能提示肝硬化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加，而應(yīng)該及時(shí)進(jìn)行有關(guān)檢查，以早期做出診斷。HCV感染后肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞釋放的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素對(duì)Th17細(xì)胞造成較大刺激而促進(jìn)了Th17細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[6-10]。Th17細(xì)胞的增加又會(huì)促進(jìn)血清IL-17的分泌，發(fā)揮抑制肝細(xì)胞凋亡的作用[11，12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[13]，Th17 細(xì)胞表達(dá)的上調(diào)會(huì)加重肝細(xì)胞炎癥和肝硬化的發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者外周血Th17細(xì)胞和血清IL-17水平比慢性丙型肝炎患者升高不明顯，可能提示HCV感染患者Th17細(xì)胞增多有利于HCV感染的自行恢復(fù)，對(duì)肝硬化的發(fā)生有一定的保護(hù)作用，與上述研究結(jié)論相悖，考慮與研究對(duì)象不同有關(guān)，具體原因尚不明確，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。機(jī)體感染HCV后，受到感染的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素，對(duì)Th17細(xì)胞造成刺激而促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，增加了IL-17的分泌[14]，故與健康人相比，慢性丙型肝炎患者外周血Th17細(xì)胞比率和血清IL-17水平均相對(duì)升高，與本研究所得結(jié)論類似。Th17細(xì)胞的增多又會(huì)進(jìn)一步加重肝細(xì)胞炎癥，誘導(dǎo)肝硬化的發(fā)生。也有學(xué)者認(rèn)為[15]，HCV感染后Th17細(xì)胞的增加是一種保護(hù)效應(yīng)，主要通過增加IL-17的分泌，抑制受到HCV感染的肝細(xì)胞的凋亡，使肝細(xì)胞免受損傷，并抑制HCV感染擴(kuò)散。

肝硬化患者外周血Treg細(xì)胞和血清TGF-β水平的變化保持相同的趨勢(shì)，肝硬化患者外周血Treg細(xì)胞為（6.27±1.02）%，顯著高于慢性丙型肝炎患者的（5.75±0.84）%或健康人的（5.37±0.99）%，血清TGF-β水平為（5.20±1.35）ng/L，顯著高于慢性丙型肝炎患者的（4.41±1.20）ng/L或健康人的（4.19±1.07）ng/L。ROC曲線分析研究顯示Treg細(xì)胞比率或Th17/Treg比值能提示肝硬化的發(fā)生，而在慢性丙型肝炎患者，它們的升高不明顯。機(jī)體感染HCV后肝細(xì)胞中半乳糖凝集素和GF-β表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)了Treg細(xì)胞分化，抑制HCV特異性T細(xì)胞的增殖和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌[16]，故隨著HCV感染患者病情的加重，Treg細(xì)胞比率和血清TGF-β水平升高，顯著高于健康人。病情進(jìn)一步進(jìn)展至肝硬化后，Treg細(xì)胞比率和血清TGF-β水平會(huì)持續(xù)升高，考慮Treg細(xì)胞分化與TGF-β高表達(dá)是HCV感染患者進(jìn)展為肝硬化的主要機(jī)制之一，在丙型肝炎慢性化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促進(jìn)作用[17，18]。TGF-β主要由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌，其具有激活肝星狀細(xì)胞的作用，被公認(rèn)是肝臟纖維化的主要原因[19，20]。我們認(rèn)為，機(jī)體感染HCV后誘導(dǎo)肝內(nèi)細(xì)胞表達(dá)TGF-β，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化，造成丙型肝炎慢性化，并在該過程中出現(xiàn)肝纖維化。另外，慢性丙型肝炎患者血清IL-6水平顯著高于健康人，提示低濃度的IL-6和TGF-β水平可能是通過協(xié)同作用，促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，造成Th17/Treg細(xì)胞比值失衡，使HCV感染患者發(fā)生慢性化感染，并促進(jìn)肝硬化進(jìn)展[21，22]。有證據(jù)表明，采用抗病毒治療的丙型肝炎肝硬化患者在治療后，血清HCV RNA水平大幅降低，患者Treg細(xì)胞比率也明顯降低，Th17/Treg細(xì)胞比值平衡恢復(fù)，對(duì)HCV特異性Th17細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，部分受損Th17細(xì)胞功能得以恢復(fù)，減少了IL-17的分泌，增強(qiáng)了抗病毒作用。