雌激素對一氧化碳中毒遲發型腦病大鼠海馬的影響

明 利，辜剛鳳，紅 艷，雷蕊綺，蔣 力，李經倫

(1.成都天府新區人民醫院神經內科，四川 成都 610213；2.西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 646000；3.西南醫科大學附屬醫院神經內科，四川 瀘州 646000)

一氧化碳(CO)中毒是最為常見的致命性空氣中毒，因其神經損害嚴重，臨床癥狀多且復雜，治療及預后不佳，造成了一系列嚴重的健康問題[1]。部分患者在發生CO中毒癥狀恢復后經過約2周左右的無癥狀期后，可出一系列神經系統癥狀和體征，主要為表現為記憶、認知功能、內臟自主神經系統功能障礙等，稱為急性CO中毒遲發性腦病(DEACMP)[2]。雌激素是人體內常見甾體類固醇激素，具有抗氧化應激、抑制細胞凋亡、改善線粒體功能、協調神經營養因子表達等功能[3]。在阿爾茨海默病、帕金森病等神經系統疾病中具有一定的保護作用。胡慧軍等在CO中毒遲發型腦病臨床實驗中發現，在相同的中毒環境下，絕經前女性中毒程度更輕、預后更好，并首次提出女性生殖激素可能在CO中毒后的腦損傷中具有保護作用[4]。髓鞘堿性蛋白(MBP)及髓過氧化物酶(MPO)與多種神經系統疾病的發生密切相關，可作為炎癥、應激指標評估神經系統損傷的程度。本文探討雌激素在CO中毒遲發性腦病中的作用，在實驗中建立了DEACMP大鼠模型，測定雌激素在DEACMP中對大鼠血清 MBP、MPO的表達影響，為雌激素在CO中毒遲發型腦病的臨床治療中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組2017年10月，西南醫科大學選用雄性SD鼠(250-300 g)72只隨機分為空氣組、CO組和雌激素組，每組各設置3個亞組，每個亞組8只大鼠。大鼠由西南醫科大學動物中心提供，飼養在恒溫干凈的房間，溫度(22±2) ℃，設置為12 h光暗周期。

1.2 急性CO中毒大鼠模型的制作及檢測將實驗大鼠按首劑100 ml/kg腹腔注射CO氣體，后分別間隔4、8、12小時追加注射首劑的一半。隨后隨機抽取每個亞組大鼠1只，分別于染毒前及首次染毒后15 min及每隔兩小時至20 h時分別取鼠尾靜脈血0.5 ml血氣分析測定HbCO濃度。于造模結束后，雌激素組大鼠每天9：00-10：00時皮下注射溶有10 μg 17β一雌二醇的0.1 ml大豆油。CO組空氣組和對照組皮下注射0.1 ml大豆油，直至處死。

1.3 Morris水迷宮將水迷宮放在避光避聲的房間，水溫保持在(20±1) ℃。大鼠每天訓練2次，設定最長游動時限為120秒，以記錄大鼠找到平臺時間稱逃避潛伏期。考慮大鼠中毒后短時間內不能進行水迷宮實驗，我們的水迷宮實驗選擇造模前及從第3天開始進行，因嚴重急性CO中毒會導致大鼠無法進行水迷宮試驗的大鼠將被淘汰。訓練6天，第7天正式進行定位導航和空間探索，造模前淘汰有認知功能障礙大鼠，造模后篩查出發生遲發型腦病大鼠并做標記。

1.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)在大鼠染毒后2小時、7天、14天、21天各亞組大鼠鼠尾靜脈取血5 ml進行MBP和MPO血清濃度測定。

1.5 標本制作各亞組大鼠在相應時間點，使用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射將大鼠深度麻醉迅速進行心臟灌洗固定后取腦行HE染色。

1.6 統計學方法采用SPSS 23.0統計軟件分析數據。計量資料以均數±標準差表示，重復測量數據比較采用方差分析及LSD-t檢驗；穿越平臺次數用非參數秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 動物中毒改變行為學大鼠腹腔注射CO后出現輕度活躍，煩躁，呼吸急促，部分大鼠出現明顯躁狂、角弓反張。再次追加CO時大鼠表現為四肢癱軟、口唇黏膜發紺及肢體末端出現明顯櫻桃紅色，甚至出現昏迷及死亡(圖1，圖2)。整個染毒過程，CO組大鼠死亡11只，雌激素組死亡4只，空氣組大鼠全部存活，死亡大鼠及時用備用大鼠補充。CO組大鼠16小時內檢測其COHb濃度為(54.09±3.67)%，而空氣組COHb濃度為(0.65±0.28)%。

圖1 大鼠CO中毒后出現昏迷

圖2 大鼠CO中毒后口唇粘膜出現櫻桃紅色

2.2 水迷宮試驗結果在水迷宮試驗中，CO組大鼠逃避潛伏期在第3～21天均大于空氣組(P<0.05)；CO組與雌激素組大鼠分別在14天和7天相比逃避潛伏期明顯延遲(P<0.05)，空氣組在各時間點逃避潛伏期無明顯延遲(P> 0.05)，見表1。在空間探索實驗中，CO組較空氣組及雌激素組在第14天時穿過平臺次數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 HE染色結果空氣組大鼠在各時間點海馬CA1區細胞排列整齊，細胞結構完整；CO中毒組海馬組織神經元腫脹，細胞核出現固縮、破碎，染色質碎裂，胞質和胞核界限不清；雌激素處理組在各時間點神經元細胞壞死和CO中毒組相比一定程度上減輕。見圖1。

表1 三組大鼠各時間點逃避潛伏期比較 (s)

a與空氣組比較，P<0.05；b與雌激素組比較，P<0.05；c與造模前及3d、7d比較，P<0.05

圖1 各組海馬組織在14天HE染色(×400倍) a：空氣組海馬CA1正常細胞；b：CO組海馬CA1細胞壞死明顯；c：雌激素海馬CA1細胞。

2.4 酶聯免疫法空氣組大鼠血清MBP、MPO濃度無明顯差異，差異無統計學意義(P> 0.05)。CO組MBP水平明顯高于空氣組和雌激素組(P<0.05)(表2)。CO組在第14天MPO濃度水平較空氣組及雌激素組也明顯增加(表3)。

表2 三組大鼠各時間點MBP水平 (μg/L)

a與空氣組及雌激素組比較，P<0.05

表3 三組大鼠各時間點MPO水平 (μg/L)

a與空氣組及雌激素組比較，p<0.05

3 討論

目前DEACMP的發病機制尚不明確，很多臨床及動物實驗發現其發病與炎癥反應、免疫損傷、氧化應激、細胞凋亡、腦白質脫髓鞘等可能存在關系[5，6]。既往研究證實海馬發揮著認知、學習、記憶等重要功能，其損傷和多種疾病的發生密切相關[7]。我們的實驗結果顯示，CO中毒后大鼠海馬組織出現了嚴重的病理損傷，主要表現為出現大量變性和壞死的神經元，在中毒第14天時達到高峰。Morris水迷宮主要檢測大鼠的空間記憶能力，主要涉及海馬相關腦區，在本實驗水迷宮實驗中結果中大鼠在CO中毒后的14～21天，逃避潛伏期出現明顯延遲，空間探索中經過目標象限的次數也明顯減少，說明大鼠在第14～21天發生了遲發型腦病導致的記憶認知功能損傷。因此我們通過水迷宮實驗和海馬組織學分析篩選出在急性CO中毒后出現了遲發型腦病的大鼠用于實驗研究是有效的。

美國學者在研究中發現CO中毒后，腦內自由基生成增加可引起脂質過氧化，導致腦內MBP的改變[8]。MBP作為髓鞘中抗原活性最強的蛋白質，位于髓鞘漿膜面，能夠維持髓鞘結構和功能的穩定[9]。當中樞神經系統遭受損傷時，髓鞘受到破壞，血腦屏障及通透性改變，可造成MBP在血清中濃度增高[10]。研究表明，MBP在腦損傷、脫髓鞘疾病、缺血性腦血管病、神經退行性疾病及慢性神經性疼痛疾病中廣泛存在，可作為神經系統相關性損傷標志物[11，12]。本文實驗結果可以看出，急性CO中毒后血清MBP明顯增加，說明在CO中毒后大鼠存在脫髓鞘改變，發生了MBP的降解，導致血清MBP濃度的增加，進一步證明MBP可能參與了急性CO中毒后遲發性腦病的發病過程。而MPO作為一種獨立于其他炎癥因子的一種新的炎癥因子，與人類多種疾病的發生、發展密切相關，是炎癥和氧化應激的標志物[13]。MPO能通過氧化作用產生的自由基，造成與神經元損傷，因其水平與中性粒細胞的活化密切相關，可作為中性粒細胞功能和活化的標志[14]。本研究表明急性CO中毒后可能出現逐漸加重的炎癥反應，MPO增高可能激活中性粒細胞并引發炎性反應，限制紅細胞中的氧轉運，導致組織缺氧，進一步出現遲發型腦病。

近年來很多實驗發現雌激素在腦外傷、卒中、神經變性疾病中發揮重要的保護作用[15]。其能透過血腦屏障，聚集在腦組織的不同部位，如皮質及海馬區、下丘腦等，與細胞內受體結合，通過抑制細胞凋亡、抗氧化應激、抗炎、加速病理性蛋白的清除起到神經保護以及提高認知的目的[16]。人體雌激素有三種類型，17-β雌二醇(17-βestradio，17-βE2)、雌酮(Estrone)和代謝產物雌三醇(estriol)，其中17-β雌二醇生物效能最強。因此在我們實驗中選擇17-βE2治療CO中毒大鼠，并評估其療效。實驗結果顯示與CO中毒組相比，雌激素治療組大鼠在中毒后7天和14天的逃避潛伏期明顯縮短，在空間探索實驗中，在第21天時穿過平臺次數明顯增多。在HE染色結果中，雌激素治療組在各時間點海馬組織水腫和神經元細胞壞死減輕，正常神經元細胞數目增多。而在對血清MBP、MPO測定結果中顯示，雌激素治療組各時間點MBP水平明顯于低于CO組。與CO中毒組相比，雌激素組MPO水平在第14天也明顯減少。說明大鼠發生急性CO中毒后，出現脫髓鞘改變、免疫炎癥反應等，而雌激素雌激素可通過多種途徑改善代謝，減輕氧化應激誘導的免疫炎癥反應損傷，有效保護神經細胞和組織。

本實驗中，CO中毒后，MBP及MPO的表達均明顯增加，而在使用雌激素治療后MBP及MPO的表達減少。雌激素可能通過抑制CO中毒大鼠后MBP、MPO的表達，阻斷中性粒細胞的活化和炎癥反應介導的神經損傷，減少細胞壞死，減輕脫髓鞘損傷，維持髓鞘結構和功能的穩定，一定程度上阻斷了遲發型腦病的發生，從而起到保護作用。但目前其具體發病機制尚不明確，還需進一步實驗研究。