肺炎支原體RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和血清抗體法在兒童肺炎支原體檢測(cè)中的比較

王紫荊，趙 云，胡小林，方 劍，尹清金，侯曉華，謝屹峰，謝光莉，馬云馳，莊 琴，謝巧林，周曉玲

(成都兒童專(zhuān)科醫(yī)院內(nèi)科一病區(qū)，四川 成都 610015)

支原體(MP)肺炎是由肺炎支原體引起的常見(jiàn)兒童呼吸道感染性疾病，主要臨床表現(xiàn)有：持續(xù)高熱、畏寒、厭食、劇烈咳嗽、頭痛、咽痛、胸骨下疼痛等癥狀，占肺炎住院患兒的10%～40%[1]，部分患兒可引起神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和皮膚、肌肉、關(guān)節(jié)等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患兒的身體健康，故需盡早明確診斷、及時(shí)治療，但由于支原體肺炎的臨床征象和影像學(xué)不具有特征性[2]，給臨床早期診斷帶來(lái)困難。本研究采用肺炎支原體RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和血清抗體法同時(shí)對(duì)不同年齡、不同病程肺炎患兒進(jìn)行支原體病原學(xué)檢測(cè)，評(píng)價(jià)兩種方法的檢測(cè)率，探討肺炎支原體RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在兒童肺炎早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年3月至2018年12月在成都兒童專(zhuān)科醫(yī)院住院的患兒2647例，男1501例，女1146例，入組標(biāo)準(zhǔn)：參照《兒科學(xué)》第八版兒童肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：有發(fā)熱(部分可無(wú)發(fā)熱)、咳嗽、呼吸急促、肺部中細(xì)濕羅音、胸部影像學(xué)有肺炎改變。排除年齡≤28天的新生兒，本次入院前曾服用過(guò)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物者。所有患兒于入院當(dāng)日同時(shí)作咽拭子支原體RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)、血清支原體抗體檢測(cè)，還需作痰細(xì)菌培養(yǎng)、肝腎功能、心肌酶譜、電解質(zhì)和X射線片、血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)等檢查，予以抗感染、霧化吸入、止咳化痰、退熱等處理。

1.2 方法儀器與試劑：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由西安天隆科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：TL988；試劑采用上海仁度生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑盒；支原體血清抗體檢測(cè)采用日本富士瑞必歐株式會(huì)社生產(chǎn)的肺炎支原體抗體檢測(cè)試劑盒。

1.2.1咽拭子肺炎支原體RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)

分為核酸提取和恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)2個(gè)步驟。在核酸提取過(guò)程中，支原體裂解釋放出的核酸借助核酸提取液中的捕獲探針與磁性顆粒特異結(jié)合，通過(guò)清洗磁性顆粒而獲得純凈的MP靶標(biāo)核酸(RNA)；在恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)過(guò)程中，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7.RNA多聚酶和優(yōu)化探針技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個(gè)DNA拷貝，T7.RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)RNA拷貝，帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，該熒光信號(hào)可由檢測(cè)儀器捕獲。檢測(cè)結(jié)果根據(jù)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的出現(xiàn)時(shí)間和強(qiáng)度，結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、內(nèi)標(biāo)信號(hào)和熔解曲線對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.2支原體血清抗體檢測(cè) 被動(dòng)凝集法；采用富士瑞必歐株式會(huì)社生產(chǎn)的肺炎支原體抗體檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。血清學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)畏菅蹇贵w滴度≥1：160為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢出率的比較采用配對(duì)四格表資料χ2檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方法的檢出率比較2647例兒童肺炎患兒中支原體RNA恒溫?cái)U(kuò)增法檢出肺炎支原體284例，檢出率10.73%，支原體血清抗體法檢出肺炎支原體212例，檢出率為8.01%，兩種方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.56，P< 0.05)，見(jiàn)表1。

表1 RNA恒溫?cái)U(kuò)增法與血清抗體法支原體檢出率比較 (n=2647)

2.2 不同病程患兒兩種檢測(cè)方法的檢出率比較病程≤7天組有1809例患兒，其中支原體RNA恒溫?cái)U(kuò)增法檢出肺炎支原體199例，檢出率11 %，支原體血清抗體法檢出肺炎支原體137例，檢出率7.57 %，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.38，P< 0.05)。病程>7天組有838例，其中支原體RNA恒溫?cái)U(kuò)增法檢出肺炎支原體85例，檢出率10.14%，支原體血清學(xué)抗體法檢出肺炎支原體75例，檢出率8.95%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.94，P> 0.05)，見(jiàn)表2。

表2 病程≤7天和病程>7天患兒RNA恒溫?cái)U(kuò)增法與血清抗體法支原體檢出率比較

3 討論

支原體肺炎是兒童肺炎的常見(jiàn)類(lèi)型，其臨床表現(xiàn)和影像學(xué)沒(méi)有特征性，在沒(méi)有病原檢查之前，容易與病毒性肺炎相混淆，故尋找一種早期、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出肺炎支原體的方法，對(duì)臨床診斷、治療和防止抗菌素的濫用都有十分重要的意義。

肺炎支原體感染的確診，必須依賴(lài)于病原學(xué)檢查，目前支原體感染的病原學(xué)檢查主要有以下四種檢測(cè)方法：肺炎支原體分離和培養(yǎng)、支原體抗原檢測(cè)、支原體血清特異性抗體檢測(cè)、支原體核酸擴(kuò)增技術(shù)。支原體分離和培養(yǎng)是診斷支原體感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但常規(guī)支原體培養(yǎng)方法，條件要求苛刻，支原體生長(zhǎng)緩慢，常規(guī)培養(yǎng)需要10～14天，甚至更長(zhǎng)時(shí)間，盡管其檢出準(zhǔn)確率高，但該方法費(fèi)時(shí)、繁瑣，培養(yǎng)靈敏度低，不利于支原體感染的早期快速診斷；支原體快速培養(yǎng)方法是利用快速繁殖的肺炎支原體分解葡萄糖而產(chǎn)酸，產(chǎn)生大量氫離子，降低了培養(yǎng)基的PH值，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑從紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，來(lái)間接判斷培養(yǎng)基中有肺炎支原體生長(zhǎng)，但其敏感性較低，特異性低，易受到真菌等因素影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性[3]；支原體抗原檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，適合于臨床早期診斷的要求，但患者咽拭子、痰液標(biāo)本中肺炎支原體的含量低，不經(jīng)過(guò)支原體擴(kuò)增的抗原檢測(cè)靈敏度不高，因此在能利用核酸擴(kuò)增技術(shù)診斷時(shí)，不推薦應(yīng)用抗原檢測(cè)診斷；目前臨床上較為流行的檢測(cè)方法為支原體血清抗體法，但目前抗體診斷試劑敏感性不高，其檢查結(jié)果受患兒病程和年齡因素的影響。在支原體感染早期，支原體抗體尚未產(chǎn)生，早期檢測(cè)可出現(xiàn)假陰性；嬰幼兒由于免疫功能尚未發(fā)育完善，B細(xì)胞功能不足，產(chǎn)生抗體的能力較低，也可能出現(xiàn)假陰性[4]；支原體DNA核酸擴(kuò)增技術(shù)可直接檢測(cè)患兒咽拭子或痰液標(biāo)本中肺炎支原體的DNA，具有敏感度高和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，可用于支原體感染的早期診斷，但菌體死亡后其DNA可持續(xù)存在數(shù)月，故無(wú)法區(qū)分“死菌”和“活菌”，無(wú)法判斷療效，且易引發(fā)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)交叉污染[1，5～7]，易出現(xiàn)假陽(yáng)性；支原體RNA核酸擴(kuò)增法是目前最新的分子診斷方法，模板和檢測(cè)都是用RNA做模板，RNA僅存在活菌中，菌體死亡后RNA快速降解，相比較傳統(tǒng)DNA核酸擴(kuò)增技術(shù)，能有效區(qū)分“死菌”和“活菌”，在疾病初期、潛伏期、療效判斷、預(yù)后等各個(gè)階段能給臨床提供非常有價(jià)值的信息，另外，不存在交叉污染，具有檢測(cè)時(shí)間短，敏感度、特異度高，不會(huì)受到患兒年齡因素的影響[8]。

綜上，支原體RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可以作為一種新的方法用于肺炎支原體感染的早期臨床病原檢測(cè)，可以提高支原體感染的診斷水平，值得臨床大力推廣應(yīng)用。