凍存復(fù)蘇及4℃存放對成纖維細(xì)胞的影響

李瑩　王英　羅浩虹　吳娟英

【摘 要】目的：探索凍存復(fù)蘇及4℃存放對細(xì)胞活性的影響。方法：培養(yǎng)細(xì)胞，凍存復(fù)蘇后，利用臺盼藍(lán)染色和MTT法檢測細(xì)胞的活性。結(jié)果：臺盼藍(lán)染色顯示，未凍存的活力平均為96.57±1.21（%），而凍存細(xì)胞的細(xì)胞活力平均為74.29±2.14（%），兩組有顯著性差異（P<0.01）。4℃保存的細(xì)胞存放超過3h以上（第4h開始），細(xì)胞的存活顯著降低。兩組細(xì)胞之間的吸光度也出現(xiàn)同樣趨勢。

結(jié)論：細(xì)胞在4℃保存，3h內(nèi)可保持活力不變。

【關(guān)鍵詞】成纖維;臺盼藍(lán);MTT

中圖分類號： R114 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）29-0210-001

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.29.099

隨著生物及細(xì)胞類制劑的增多，細(xì)胞在越來越多方面應(yīng)用，而細(xì)胞的存放往往限制了細(xì)胞的應(yīng)用。成纖維細(xì)胞是臨床常用的一種細(xì)胞，可以促進(jìn)細(xì)胞表皮遷移、增殖和分化[1]，培養(yǎng)方法相對成熟，性狀穩(wěn)定，存活能力強，是細(xì)胞制劑中的種子細(xì)胞。本實驗以小鼠成纖維細(xì)胞為研究對象，初步確定了復(fù)蘇后以及4℃保存狀態(tài)下的細(xì)胞狀態(tài)，為細(xì)胞的臨床使用提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

主要試劑：IMDM培養(yǎng)基，PBS（pH=7.4），胎牛血清，L-谷氨酰胺，青鏈霉素抗生素，0.25%胰蛋白酶（invitrogen，美國），多聚賴氨酸（sigma，美國），0.5%MTT溶液、20%SDS，臺盼藍(lán)試劑（sigma，美國）。

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（Thermo，德國）、低速離心機、6孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板（Corning，美國），倒置顯微鏡（Olympus，日本）、酶標(biāo)分析儀、超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞的制備

取無菌條件下的小鼠皮膚組織2塊，分離真皮，剪成小塊，加0.25%胰蛋白酶反復(fù)吹打消化，用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基清洗，離心1200r/min，8min，棄上清，按1×105/ml細(xì)胞濃度加10%牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，據(jù)細(xì)胞生長情況傳代和換液。

1.2.2 細(xì)胞的凍存

收集培養(yǎng)好的細(xì)胞，加入細(xì)胞凍存液（5%DMSO+45%胎牛血清），采用梯度降溫法凍存：現(xiàn)象細(xì)胞置于4℃冰箱內(nèi)放置1h，-20℃冰箱內(nèi)放置2h，-80℃超低溫冷凍過夜，最后置于液氮中保存。

1.2.3 凍存后復(fù)蘇

取凍存3個月的細(xì)胞，37℃水浴，快速解凍，離心洗滌后備用。

1.2.4 臺盼藍(lán)染色

將新鮮培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞與復(fù)蘇后的細(xì)胞懸液分別與3μL 0.4%的臺盼藍(lán)染液混合，取少許混合液置于血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)池，于普通顯微鏡下記錄計數(shù)板4個大方格內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。另取一組細(xì)胞，按時間（時間間隔為1h）依次取出細(xì)胞懸液加培養(yǎng)液至1ml，混勻，取其中的90μL細(xì)胞懸液與10μL 0.4%的臺盼藍(lán)染液混合，取少許混合液充至血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)池，1min內(nèi)讀數(shù)，于普通顯微鏡下記錄計數(shù)板內(nèi)四個大方格內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，胞核藍(lán)染者為死細(xì)胞。分別計算細(xì)胞存活率。

1.2.5 MTT染色

分別將上述細(xì)胞的細(xì)胞懸液混合均勻，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，每孔100ml，置于37℃，5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，3-4d后按順序加入10μL 0.5%的MTT溶液，繼續(xù)孵育培養(yǎng)6-8h后，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶;加入10μL 20%的SDS，繼續(xù)孵育過夜，使結(jié)晶溶解，取出用酶標(biāo)儀570nm比色，讀取各組吸光度值，算取平均值為橫坐標(biāo)，時間為縱坐標(biāo)繪制折線圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

各組計量資料統(tǒng)計學(xué)處理采用SAS軟件（9.0版本）行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 臺盼藍(lán)染色

細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，普通顯微鏡下可見活細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核透亮，死細(xì)胞核藍(lán)染。未凍存的細(xì)胞活力平均為96.57±1.21（%），而凍存細(xì)胞的細(xì)胞活力平均為74.29±2.14（%），兩組有顯著性差異（P<0.01）。將4℃存放的細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)可見，4℃保存3h以內(nèi)，細(xì)胞的存活率無顯著性差異（P>0.05），而存放超過3h以上（第4h開始），細(xì)胞的存活率有顯著性差異（P<0.05）。

2.2 MTT染色

活細(xì)胞中的琥珀酸脫氧酶可使MTT分解產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶狀甲瓚顆粒，聚集于細(xì)胞內(nèi)或其周圍，其吸光度值與細(xì)胞數(shù)呈正比，間接反應(yīng)細(xì)胞的增殖活性。實驗結(jié)果顯示，4℃保存的細(xì)胞，在3h以內(nèi)的各組細(xì)胞吸光值之間無顯著性差異（P>0.05），4h后各組的細(xì)胞吸光值之間有顯著性差異，并有明顯的下降趨勢。

3 討論

細(xì)胞屬于生物制品，因此在臨床應(yīng)用中的使用不像藥品，需要注意存放的溫度，存放時間等。在本文的實驗研究中，我們著重解決了兩個問題，一是凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率問題，二是用于臨床的細(xì)胞在4℃存放的最長有效時間問題。細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇是細(xì)胞實驗中遇到的常規(guī)問題。由于組織的取材受時間地點等因素的限制，加之細(xì)胞的培養(yǎng)需要一定的時間，培養(yǎng)好的細(xì)胞不一定馬上應(yīng)用于臨床，因此常將細(xì)胞低溫凍存。成纖維細(xì)胞的凍存方法較多，目的是盡量減少凍存后對細(xì)胞的損傷。保護劑的選擇、溫度的控制及冷凍程序等的不同都會影響細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率、活性及克隆形成。現(xiàn)已證實，液氮凍存比-80℃冰箱的凍存效果好[2]。在本次實驗中，我們采用5%DMSO+45%胎牛血清的凍存液，確保最佳凍存效果[3]。實驗結(jié)果顯示，凍存復(fù)蘇后細(xì)胞的細(xì)胞存活率及細(xì)胞活力較未凍存細(xì)胞均有顯著性差異，說明液氮凍存對細(xì)胞的確存在損傷，但復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率仍可達(dá)到70%左右，而4℃保存3h以內(nèi)，細(xì)胞活力不變。

【參考文獻(xiàn)】

[1]陳渴，張會波.原代人尿道狹窄成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2019，14（5）：1225-1227.

[2]游小燕，何琦琳，劉雪芹，等.一種無血清凍存液在豬胎兒成纖維細(xì)胞上的應(yīng)用研究[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2019，25（1）：69-73.

[3]白艷艷，繆競誠，張占英，等.不同凍存方法對臍血造血細(xì)胞的影響[J].蘇州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）2004;24（6）：839-840.