櫻桃葉單寧的分布及累積特征

張超越，張茹涵，梁棟，李海剛，王守箐，劉林

（臨沂大學藥學院，山東臨沂 276005）

單寧是由植物細胞合成的一類天然酚類化合物，產量僅次于纖維素、半纖維素和木質素[1]。單寧可分為水解性單寧和非水解性單寧，后者又稱凝縮性單寧或原花青素[1-5]。水解性單寧是沒食子酸與多元醇酯化產物及其衍生物，最常見的多元醇是β-D-葡萄糖[2-3]。非水解性單寧是黃酮類化合物的聚合物，最常見的單體是兒茶素和表兒茶素[4-5]。單寧溶于水，能吸收紫外線，與蛋白質反應，引起蛋白質結構和性質發生變化，從而破壞其正常功能，這一性質賦予單寧殺菌功能[6]。單寧與蛋白質作用的性質使草食性動物不愿取食那些積累大量單寧的植物，從而使植物免受這些動物傷害[7]。紫外線破壞蛋白質和DNA 等生物大分子的結構和功能，細胞通過積累單寧保護蛋白質和DNA 免受紫外輻射傷害[8-9]。因此，積累單寧是植物的一種自我保護機制[6-9]。研究表明，單寧具有抗氧化及抑制腫瘤等生物活性[10]。由于上述特性，單寧在食品、化妝品、醫藥、制革、造紙、冶金、水處理等許多領域得到應用。

了解植物葉器官單寧分布的特征，有助于分析其抵御病原菌侵染和紫外輻射傷害機制。櫻桃是栽培面積較大的果樹，但櫻桃葉單寧積累的特征研究還鮮有報道。本研究采用組織化學和超微技術對櫻桃葉單寧分布進行了顯微和超微分析，了解了單寧積累及其分布特點，從而揭示櫻桃單寧的紫外輻射和病原菌防御機制，同時拓寬對櫻桃生物學的認識，為單寧資源研究增添信息，也為櫻桃葉的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試櫻桃（Cerasus pseudocerasus）品種為金紅櫻桃，栽種于臨沂大學校園內，樹齡6 年，常規管理，長勢良好。

1.2 組織化學方法

四氧化鋨檢測法：單寧與四氧化鋨作用產生棕色至黑色產物[11-13]，據此，從櫻桃樹上剪取葉片，將葉片組織用2.5%戊二醛溶液固定后在1%四氧化鋨溶液中浸泡4 h，再后用酒精脫水脫色，包埋于樹脂中，切片，厚度為1 μm，顯微鏡下觀察單寧。

三氯化鐵檢測法：利用單寧與三氯化鐵反應產生藍綠色的性質[14-15]，從櫻桃樹上取葉片，將葉片組織固定后在三氯化鐵溶液中浸泡12 h，然后用酒精脫水脫色，包埋于樹脂中，切片，厚度1 μm，顯微鏡下觀察單寧。

1.3 透射電子顯微技術

從樹上取下葉片，將小于1 mm2的組織小塊用2.5%戊二醛溶液（用0.05 mol/L 磷酸緩沖液配制）固定12 h，再用1%四氧化鋨溶液固定4 h，酒精脫水，丙酮置換酒精，之后用Epon-812 樹脂包埋，切片，厚度為60 nm，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染[13]，透射電鏡下觀察單寧。

2 結果與分析

2.1 櫻桃葉片的顯微特征

圖1 顯示了櫻桃葉片的顯微結構，由圖可知，櫻桃葉片由表皮、葉肉和葉脈三個基本部分組成。上表皮細胞比下表皮細胞大，因而上表皮細胞數目較下表皮少。葉肉分化為柵欄層和海綿層，柵欄層細胞排列緊密，細胞間隙極小，而海綿組織細胞排列疏松，細胞間隙大。大小不同的葉脈構成脈序，大葉脈由維管束及其與表皮間的薄壁組織構成，薄壁細胞與相鄰的葉肉細胞不同，細胞較大，葉綠體少，常見簇狀結晶體。維管束位于海綿組織，距葉片下表皮較近。維管束被一層排列緊密的葉肉細胞包圍，這層細胞構成維管束鞘。木質部位于近上表皮側，韌皮部位于近下表皮側，韌皮部細胞較木質部細胞小。

圖1 葉片顯微結構Fig.1 Microstructure of leaf blade

2.2 櫻桃幼葉單寧分布特征

圖2（見下頁）顯示了櫻桃幼葉單寧的分布特征，由圖可知，幼葉葉片沒有展開時，細胞排列緊密，沒有細胞間隙，葉肉細胞尚未分化，沒有柵欄組織和海綿組織之分。維管組織處于發育早期，還沒有分化形成木質部和韌皮部（圖2A）。

綜合不同方法的檢測結果，可以得出，單寧在幼葉中的積累有如下特點：第一，單寧不是在所有細胞中積累，而是只在部分細胞中積累（圖2A-C），積累單寧的細胞與不積累單寧的細胞相鄰，表明單寧不會從一個細胞向另一個細胞擴散，這是由單寧大分子特征及其與蛋白質作用的性質所決定的；第二，維管組織邊緣細胞積累較多單寧，維管組織與表皮之間的細胞也積累較多單寧（圖2A），表皮細胞積累較多單寧，將分化為葉肉的那些細胞積累較少單寧（圖2B、C）。第三，單寧只在液泡中積累，被完全限制在液泡內（圖2D、E）。

圖2 幼葉中的單寧Fig.2 Tannin accumulation in young leaves

2.3 櫻桃成熟葉片中單寧的分布

圖3 顯示了櫻桃成熟葉片中單寧的分布，由圖可知，葉片成熟時，葉肉組織分化成柵欄層和海綿層，前者排列緊密，后者排列疏松（圖3A），維管組織分化出木質部和韌皮部（圖3B）。成熟葉單寧積累有如下特點：第一，葉肉細胞，包括柵欄細胞、海綿細胞和圍繞維管組織的葉肉細胞，即維管束鞘細胞積累較多單寧（圖3A-D），相反，表皮（圖3A、E）、維管組織（圖3A、B、E、F）和維管組織與表皮之間的細胞（圖3A）積累單寧明顯較少；第二，各種組織中不是所有細胞都積累單寧，通常有少量細胞不積累單寧；第三，與幼葉一樣，單寧在液泡中積累（圖3A-F）。

圖3 成熟葉中的單寧Fig.3 Tannin accumulation in mature leaves

3 討論

植物單寧的產生和積累與環境因素有關，特別是紫外輻射。紫外線照射增加，單寧的積累也會增多[8-9]。單寧具有吸收紫外線的性質，植物細胞積累這種酚類化合物，吸收紫外線，從而保護細胞中的DNA 和蛋白質不受紫外線損傷[8-9]。此外，單寧還具有殺菌功能，細胞積累單寧能夠防御病原菌入侵[6]。本研究表明，櫻桃幼葉和成熟葉均積累單寧，單寧分布在各種類型細胞中，這樣的積累和分布特征顯示，櫻桃葉具有以單寧為基礎的紫外線和病原菌防御機制，保護葉細胞不受紫外輻射傷害，阻止病原菌入侵。除單寧外，櫻桃葉還可能積累其他酚類化合物，即單寧不一定是櫻桃葉唯一的紫外線和病原菌防御機制。

試驗還發現幼葉表皮、維管組織以及維管組織與表皮間的細胞積累較多單寧，預定成為葉肉組織的細胞積累較少單寧；成熟葉的葉肉組織積累較多單寧，維管組織和表皮積累單寧較少，單寧的分布特征為櫻桃葉片發育和行使功能提供了有效保護。維管組織細胞體積小、數量多，染色質含量高，對紫外輻射較為敏感，單寧積累形成紫外線防御機制，對維管組織保護具有重大意義。特別在維管組織發育早期，維管薄壁細胞還在發生分裂活動，分裂期的細胞對紫外輻射高度敏感，過度紫外輻射會使維管組織發育受到嚴重影響，從而進一步影響光合產物的韌皮部卸載，造成葉肉組織營養不良，最終影響葉片正常發育，因而在維管組織發育早期防御紫外輻射極為必要，幼葉維管組織外層細胞及維管組織與表皮之間的細胞積累大量單寧，為維管組織罩上吸收紫外輻射的單寧“帽”，有效地保護維管組織。幼葉中將分化為葉肉的細胞積累較少單寧，但是表皮積累較多單寧，為這些細胞提供了保護。成熟葉中，葉肉細胞負責光合作用，制造光合產物，維管組織負責將光合產物裝載到韌皮部，運輸到花、果實、莖尖、根尖等生長旺盛的部位，為細胞分裂、生長和分化提供物質基礎，葉肉組織積累較多單寧，能夠有效防御紫外輻射傷害，保證光合作用正常進行，同時給積累單寧較少的維管組織提供保護，保證光合產物正常運輸。

很多酚類化合物具有很強的抗氧化活性、殺菌能力和抑制腫瘤的療效[6-9]，這些特點決定酚類化合物具有多方面的應用。作為大分子酚類化合物，單寧不僅在制革業具有重要應用價值，在食品、醫藥等其他領域也有重要價值，如葡萄酒的抗氧化活性就來自于葡萄中的單寧。有研究表明，將富含單寧的柿葉加入飼料，可明顯減少小鼠對飼料中脂類物質的吸收，降低體內的膽固醇、甘油酯和脂過氧化物的水平，減輕體重[10]。柿葉已被加工為茶，進入市場。電子顯微鏡下觀察，櫻桃葉與柿葉中的單寧具有非常相似的特征，因此櫻桃葉具有潛在的開發價值。