青蒿素基于PI3K/AKT信號通路對人急性髓系白血病細胞凋亡的作用機制

王 朦，賈國存*，成怡冰，王海軍，劉 煒，郭亞瓊

0 引言

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)為起源于多能干細胞的髓系增殖性腫瘤，在兒童中發病率高，預后差[1]。目前主要采用化療、干細胞移植與放療等手段進行治療，化療藥物毒副作用大，干細胞移植要求高，兼容性差，排斥反應大；放療可引起相鄰器官組織損傷。因此，尋找高效低毒、可行性高的藥物迫在眉睫[2]。隨著人們對AML研究的深入，信號通路逐漸成為其研究重點，其中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinases，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase，PKB，又稱AKT)受到了廣泛關注，與腫瘤細胞增殖、凋亡、分化、遷移等生物學行為過程密切相關，可能成為腫瘤治療的新靶點[3]。青蒿素是我國中醫學家首次從菊科植物黃花蒿中提取的新型中成藥。青蒿琥酯(Artesunate，ART)是青蒿素類衍生物，有潛在抗腫瘤作用，可抑制腫瘤細胞增殖與分化、促進細胞凋亡[4]。本文主要基于PI3K/AKT信號通路分析青蒿素對人AML細胞凋亡的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2016年10月至2018年10月我院收治的44例AML患兒，均經世界衛生組織(WHO)的MICM分型明確診斷，為初治或復發病例，且免疫表型檢測發現抗原陽性細胞≥20%，患兒家屬均對本研究內容知情且簽署知情同意書。其中，男27例，女17例；年齡9個月～14歲，平均(8.20±0.86)歲；2010年美國國家綜合癌癥網絡(NCCN)危險分級：低危、中危、高危分別16例、23例、5例。另選擇人慢性粒細胞白血病K562細胞株4株，均由中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心傳代保存。

1.2 主要儀器與試劑 儀器：5417低溫高速離心機(德國Eppondoff公司)；倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(日本，Olympus)；FACSCaliber流式細胞儀(美國BD公司)。

試劑：注射用青蒿琥酯粉針劑(廣西桂林南藥股份有限公司，60 mg/支)；RPMI-1640細胞培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州，四季春)；Trizol試劑(美國Ambiong公司)；全蛋白提取試劑盒(凱基生物技術有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)；Goat anti-Rabbit二抗(Boster公司)或HRP標記的Goat anti-Mouse二抗(Boster公司)；Western blot凝膠制備試劑盒(武漢谷歌生物公司)；β-action(中國，Abmart公司)；PI3K、AKT、P-AKT、Bcl-2、Bax、caspase-3、PTEN檢測試劑盒均購自美國CST公司。

1.3 方法

1.3.1 青蒿琥酯溶液的配制 無菌條件下，將60 mg青蒿琥酯粉針劑(1瓶)，加入5% NaHCO3溶液1 ml，振搖1 min使之充分溶解，注入RPMI-1640培養液適量，混勻，依次制成濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml的青蒿琥酯溶液，保存于-20 ℃備用，另選擇不含青蒿琥酯的RPMI-1640培養液100 ml作為對照。

1.3.2 人AML原代細胞的提取及K562細胞株的培養 將44例AML患兒隨機分為4組，各11例；K562細胞株隨機分為4組，每組1株。在無菌條件下取AML患兒骨髓液4～5 ml，加入抗凝離心管(含肝素0.3 ml)中，取等體積PBS液對骨髓液進行稀釋，充分混勻。取淋巴細胞分離液4～5 ml加入干燥離心管，將稀釋后的骨髓液緩慢加入分離液上層，于2 500 r/min下離心約20 min，取中間呈白膜狀單個核細胞層，移入另一個干燥潔凈的離心管，采用PBS液漂洗2次，之后在1 000 r/min下離心5 min，棄上清液，以1640培養液稀釋，加入75 ml培養瓶，放置在37 ℃、濕度95%、含5% CO2的培養箱中培養，每3天換液1次。K562細胞株培養于含10% 胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素的RPMI-1640培養液中，放置在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2天換液1次。取對數生長期的細胞，1 000 r/min離心5 min，以PBS洗滌細胞2次，普通培養基重懸，取30 μl細胞計數并觀察細胞活度，以每孔3×105～5×105個細胞接種在24孔板，加入相應濃度的青蒿琥酯，培養72 h。

1.3.3 細胞生長趨勢觀察 提取骨髓單個核細胞層，加入適量含20%胎牛血清的1640培養液，調細胞初始濃度為1×106個/ml。分別于提取時及培養24、48、72 h觀察并計數細胞，在低倍顯微鏡下(100×)觀察計數板細胞數，其中呈藍色染色細胞為死亡細胞，不染色細胞為活細胞，計算細胞存活率，細胞存活率=(細胞總數-藍色細胞數)/細胞總數×100%，將計數細胞懸液滴樣的所得數值求平均值。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組細胞分別培養24、48、72 h后收集，取1×106個細胞，以預冷的PBS洗滌2次，采用FACSCalibur流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.3.5 Western blot法檢測凋亡相關蛋白 制備12%分離膠和4%積層膠，微量加樣器加入20 μg總蛋白，連接電泳槽與電源正負極，濃縮膠60 V電泳30 min，分離膠100 V電泳70 min，之后將濾紙和膜置于轉膜緩沖液中平衡10 min，低溫穩流搖動，封閉60 min，按1∶3 000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，10 min/次，以HRP標記的Goat anti-Rabbit二抗(Boster公司)1∶6 000孵育相應的膜，緩慢搖動，室溫孵育120 min，漂洗，曝光10 s，以KODAK顯影液和定影液沖洗膠片，培清凝膠成像分析系統分析拍照。

2 結果

2.1 細胞生長狀態觀察 AML原代細胞、細胞株K562 24 h內細胞存活率≥80%，對照組AML原代細胞、細胞株K562 48～72 h細胞存活率仍≥70%，而實驗組AML原代細胞、細胞株K562培養48 h細胞存活率均降至50%以下，且明顯低于對照組(P<0.05)。在培養72 h后，隨著青蒿素濃度上升，原代細胞與K562細胞株的細胞存活率下降，實驗組青蒿琥酯25 μg/ml、50 μg/ml組72 h后細胞大量死亡，存活率≤10%，實驗組青蒿琥酯25.0 μg/ml組的細胞存活率最低，明顯低于12.5 μg/ml組及對照組(P<0.05)，25.0 μg/ml組、50.0 μg/ml組的細胞存活率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

圖1 不同濃度青蒿琥酯對原代細胞存活率的影響

注：*與對照組比較，P<0.05；#與青蒿琥酯12.5 μg/ml組比較，P<0.05

圖2 不同濃度青蒿琥酯對K562細胞存活率的影響

注：*與對照組比較，P<0.05；#與青蒿琥酯12.5 μg/ml組比較，P<0.05

2.2 不同濃度青蒿素對細胞凋亡相關蛋白的影響 培養48 h后，原代細胞及K562細胞株中各組中PI3K、P-AKT、Bcl-2均明顯下調(P<0.05)，而Bax、caspase-3、PTEN表達上調，見圖3、圖4。青蒿琥酯25 μg/ml組培養48 h后PI3K、P-AKT、Bcl-2低于對照組及青蒿琥酯12.5 μg/ml組，而Bax、caspase-3、PTEN最高(P<0.05)，除25 μg/ml組與50 μg/ml組外，其他各組上述指標兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，各組AKT無明顯變化，且組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、表2。

表1 不同濃度青蒿素對原代培養細胞凋亡相關蛋白的影響

注：*與對照組比較，P<0.05；#與青蒿琥酯12.5 μg/ml組比較，P<0.05

表2 不同濃度青蒿素對K562細胞株凋亡相關蛋白的影響

注：*與對照組比較，P<0.05；#與青蒿琥酯12.5 μg/ml組比較，P<0.05

圖3 不同濃度青蒿琥酯對AML原代細胞凋亡相關蛋白表達的影響

圖4 不同濃度青蒿琥酯對K562細胞凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

急性白血病為兒童時期最常見的惡性腫瘤，可分為急性淋巴細胞白血病(ALL)及AML。其中，AML為臨床及生物學特性均有異質性的惡性疾病，其長期治療仍面臨著復發率與治療相關死亡風險高及化療相關不良反應多等挑戰[5]。隨著生物醫學研究的進展，研究者針對白血病細胞增殖、分化和凋亡的不同信號轉導途徑研究出不同的抗白血病藥物，其中PI3K/AKT信號通路在近年來受到關注[6-7]。有研究發現，PI3K/AKT信號通路在人白血病細胞株K562細胞增殖與凋亡中發揮著重要作用，其活化有促進K562增殖和抑制K562凋亡的作用，因此是治療AML的新靶點[8]。青蒿琥酯為中國自主研發的青蒿素類抗瘧特效藥，作為可溶性青蒿素類衍生物，青蒿琥酯能調控細胞信號傳導、抑制腫瘤血管新生、侵襲和轉移[9]，但其對AML影響的研究較少。

細胞凋亡是一個精細的過程，經復雜的基因編碼分析網絡調控正常組織的生長及體內平衡參與凋亡，包括死亡受體介導的細胞外途徑與線粒體介導的細胞內途徑[10]，其中線粒體介導的細胞內途徑是研究重點。本研究發現，青蒿素呈濃度依賴性誘導人AML原代細胞及K562細胞株凋亡，在培養48 h后，隨著藥物濃度增加，原代細胞、K562細胞的存活率均下降，意味著更多的AML細胞凋亡，這與王瑋琴等[11]報道的不同濃度青蒿琥酯(0、1.87、3.75、7.5、15 μmol/L)青蒿琥酯處理12 h后，K562細胞與阿霉素耐藥K562細胞凋亡率依次增加的結果相近，說明青蒿琥酯可呈濃度依賴性誘導AML原代細胞或細胞株K562凋亡，青蒿琥酯為青蒿中提取的倍半萜內酯藥物，有顯著的腫瘤細胞殺傷作用，且不產生耐藥性，其對腫瘤細胞的信號傳導通路有調節作用，從而促進腫瘤細胞凋亡[12]。同時，本研究也發現，實驗組青蒿琥酯濃度為25.0 μg/ml的細胞存活率最低，25.0 μg/ml組、50.0 μg/ml組的細胞存活率比較差異無統計學意義，表明25 μg/ml可能是青蒿琥酯作用于AML的最佳劑量。

PI3K/AKT信號通路在腫瘤發生發展中發揮重要作用，PI3K的激活能促進細胞增殖與抑制細胞凋亡，AKT為PI3K下游重要的靶激酶，均是PI3K/AKT信號通路的重要組成部分，與各種生理狀態下的線粒體凋亡有關[13]。線粒體通路的基本環節為外界凋亡刺激引起線粒體膜通透性改變，導致內膜中細胞色素C釋放入細胞質中，形成凋亡小體，激活caspase-9、caspase-3，激活的caspase在細胞凋亡中起主要作用[14]，且研究也證實Bcl-2家族經Bax等凋亡基因及Bcl-2等抗凋亡基因的調節在細胞凋亡中發揮核心作用[15]。Bcl-2既可阻斷Ca2+從內質網釋放，降低Ca2+依賴性核酸內切酶活性，阻斷細胞凋亡，也可阻止caspase的活化而發揮其抗凋亡作用。Bcl-2參與抗氧化通路，可改變線粒體膜電位，調控細胞凋亡。而PTEN抗腫瘤作用主要通過其脂質磷酸酶活性，調控信號分子AKT去磷酸化而實現。本研究顯示，培養48 h后，原代細胞及K562細胞株中各組PI3K、P-AKT、Bcl-2均明顯下調，而Bax、caspase-3、PTEN表達上調，表明青蒿琥酯可能通過抑制原代AML細胞及K562細胞株中PI3K/AKT通路，調節相關凋亡蛋白(Bcl-2、Bax、caspase-3、PTEN)的表達，如活化caspase-3，誘導K562細胞凋亡，上調PTEN抑癌基因表達而抑制AKT信號通路，抑制腫瘤細胞增殖，從而促進AML細胞凋亡[16]。此外，本研究中，青蒿琥酯25 μg/ml組培養48 h后，PI3K、P-AKT、Bcl-2低于對照組及青蒿琥酯12.5 μg/ml組，而Bax、caspase-3、PTEN最高，除25 μg/ml與50 μg/ml組外，其他各組上述指標兩兩比較差異有統計學意義，證實青蒿琥酯濃度為25 μg/ml時對PI3K/AKT信號通路的抑制作用最佳，此時青蒿琥酯藥物濃度也可能達最大。

綜上所述，青蒿素類衍生物青蒿琥酯可能通過抑制PIK/AKT信號通路而調控Bcl-2、Bax、caspase-3、PTEN等凋亡相關蛋白的表達，從而促進人AML細胞及K562細胞凋亡。