二苯乙烯苷調控MAPKs信號通路誘導大腸癌SW116細胞凋亡

雷 銳，劉 艷

0 引言

大腸癌(Colorectal cancer)是常見的消化道惡性腫瘤，由美國癌癥協會發布的臨床調查數據顯示，全球大腸癌的發病率及死亡率占惡性腫瘤的第5位，且每年新出現的患者例數在不斷增加[1-2]。目前大腸癌治療的手段以手術為主，化療是重要的輔助治療方案。然而臨床發現大多數化療藥物效果不佳，毒副作用較多，術后患者生存率較低[3-4]。細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)的3個成員，介導腫瘤細胞的增殖、凋亡等多個生物過程[5]。MAPKs是連接細胞膜表面受體和基因表達的重要信號調節酶，已發現哺乳動物腸道組織細胞內至少存在4種MAPKs,即ERK、c-Jun氨基末端激酶(JNK1/JNK2)和p38 MAPK(α,β)和ERK5/BMK1，并且上述信號途徑還參與大腸腫瘤細胞增殖、分化、侵襲及遷移等生物學過程[6]。二苯乙烯苷(2,3,5,4′-etrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)主要來源于蓼科蓼族植物何首烏，屬于一種具有天然生物活性的抗毒素，其在抗氧化、抗炎癥方面發揮著重要的生物學作用[7-8]。此外，THSG在抗腫瘤方面也有較高的生物活性，包括通過調節PI3K/Akt信號通路抑制乳腺癌細胞增殖[9]；通過調節MAPKs信號通路抑制黑色素瘤細胞增殖[10]。本文以大腸癌SW116細胞為研究對象，探討了THSG對SW116細胞增殖、凋亡及MAPKs信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大腸癌SW116細胞購自ATCC；DMEM培養基購自Invitrogen公司；胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；二苯乙烯苷購自上海寶曼生物科技有限公司，批號：6634-52-6；Western blot試劑購自武漢谷歌生物有限公司；CCK8試劑盒購自上海工程生物公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物有限公司，批號：KGA106；兔抗p38、ERK、JNK、p-p38、p-ERK、p-JNK、Pro-caspase 3、Cleaved-PARP和β-actin抗體購自英國Abcam公司；JNK特異性抑制劑(SP600125)、p38特異性抑制劑(SB203580)和ERK特異性抑制劑(U0126)購自美國Sigma公司。

1.2 SW116細胞培養 將凍存于液氮中的SW116細胞株進行復蘇，待細胞貼壁飽和至適當密度后進行傳代培養，具體操作如下：從培養箱中取出培養瓶至超凈工作臺，無菌PBS清洗2遍，加入適量濃度的胰蛋白酶消化至細胞變圓，然后加入新鮮培養液終止消化，將細胞吹散后轉移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，加入含10%胎牛血清的完全培養液吹散分裝于2個培養瓶中，置于5% CO2、37 ℃恒溫條件下培養。

1.3 CCK8實驗檢測細胞增殖 把生長良好的細胞消化、重懸、接種于96孔板中，每孔加入200 μl細胞混懸液，邊緣孔用200 μl PBS填滿后培養過夜。細胞貼壁后，加入含不同濃度THSG (0、5、10、20、40、80、120 mmol/L)的培養液處理SW116細胞24、48、72 h后，取出96孔板，棄上清，每孔加入20 μl CCK8溶液，孵育2 h后采用酶標儀檢測450 nm處的吸光度OD值，并計算細胞活力。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期 把生長良好的細胞消化、重懸、接種于6孔板中，每孔加入2 ml細胞混懸液培養24 h，加入含不同濃度THSG (0、10、20、40 mmol/L)的培養液處理SW116細胞24 h后，收集細胞，懸浮細胞直接轉移至離心管，貼壁細胞胰酶消化后轉移至離心管，再用PBS清洗細胞3次，5 000 r/min離心6 min，收集細胞；將細胞重懸后分別加入5 μl Annexin V和 PI避光染色，利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.5 Western blot分析蛋白表達 把對數生長期細胞消化、重懸、接種于6孔板中，每孔加入2 ml細胞混懸液培養24 h，加入含不同濃度THSG (0、10、20、40 mmol/L)的培養液處理SW116細胞24 h后，收集細胞，加入裂解液冰上充分裂解30 min，經超聲破碎后離心取上清，100 ℃煮沸5 min使蛋白充分變性。蛋白經SDS-PAGE膠分離后將其轉移至NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。TBST洗膜2次后孵育一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，室溫孵育二抗1.5 h；TBST洗膜3次，每次10 min，ECL發光液浸泡3 min后進行曝光。

1.6 特異性抑制劑實驗 取對數期細胞接種于6孔板，待細胞貼壁生長至60%左右時，加入p38、JNK、ERK特異性抑制劑SB203580 (10 μmol/L)、SP600125 (5 μmol/L)和U0126 (8 μmol/L)單獨干預細胞1 h，然后THSG (20 mmol/L)處理24 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western blot分析相關蛋白表達。

2 結果

2.1 THSG抑制SW116細胞增殖 CCK8實驗發現THSG能明顯抑制SW116細胞增殖，見圖1。

圖1 THSG對SW116細胞增殖的影響

由圖1可見，THSG濃度在5～120 mmol/L范圍內，能夠明顯抑制SW116細胞的增殖，其抑制作用呈現劑量依賴性。對于同一劑量的THSG而言，隨著干預時間的延長，細胞的存活率降低，表現出時間依賴性。

2.2 THSG誘導SW116細胞凋亡 流式細胞儀檢測SW116細胞凋亡情況，見圖2。不同劑量(0、10、20、40 mmol/L)THSG處理SW116細胞24 h后，細胞凋亡率分別為2.6%±1.2%、7.9%±1.8%、29.4%±5.1%、47.4%±5.6%，各藥物處理組與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 THSG對SW116細胞凋亡的影響

2.3 THSG對SW116細胞中凋亡相關蛋白Pro-caspase 3和Cleaved-PARP表達的影響 Western blot檢測SW116細胞中凋亡相關蛋白Pro-caspase 3和Cleaved-PARP表達水平，見圖3。發現THSG對SW116細胞中Cleaved-PARP蛋白表達有誘導作用，而對Pro-caspase 3蛋白表達有抑制作用，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 THSG對SW116細胞中MAPKs信號通路的影響 THSG干預組與對照組比較，SW116細胞中p-ERK的相對表達水平顯著降低，而p-p38和p-JNK的相對表達水平顯著升高(P<0.05)，變化程度表現出濃度依賴性。見圖4。

2.5 抑制劑改變THSG對MAPKs信號通路及細胞凋亡 分別采用p38、JNK和ERK的特異性抑制劑SB203580、SP600125和U0126單獨干預SW116細胞1 h，之后THSG處理24 h。實驗結果發現SB203580、SP600125可以減弱THSG對p38、JNK磷酸化的誘導作用，U0126則增強了THSG對ERK磷酸化的抑制作用，見圖5。采用流式細胞儀對細胞凋亡率進行檢測，發現各組藥物干預細胞的凋亡率如下：對照組(3.4%±1.3%)、THSG組(30.7%±5.6%)、SB203580組(6.4%±1.8%)、SP600125組(4.6%±1.4%)、U0126組(37.6%±5.8%)、THSG+SB203580組(15.3%±4.2%)、THSG+SP600125組(18.7%±4.7%)、THSG+U0126組(46.9%±6.2%)，其中THSG組與THSG+抑制劑組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 THSG對SW116細胞中凋亡蛋白表達的影響

圖4 THSG對SW116細胞MAPKs信號通路的影響

圖5 特異性抑制劑對p38、JNK和ERK信號途徑活化的影響

3 討論

大腸癌在腫瘤致死亡數中所占比例較高，術后5年生存率為60%，若出現腫瘤細胞轉移，患者5年生存率不到10%[11-12]。早期較多研究發現，中藥具有多種藥理作用，如聯合化療藥物可增敏減毒、降低腫瘤的復發轉移等，在大腸癌的治療中也表現出較高的生物活性[13]。其中二苯乙烯苷(THSG)的藥理活性主要表現在抗炎和抗氧化等方面，近年來亦有THSG抗腫瘤活性的研究[9-10]。

本文采用大腸癌SW116細胞為體外研究對象，考察了THSG對SW116細胞增殖凋亡的影響。CCK8實驗發現，THSG在5～120 mmol/L范圍內對SW116細胞的增殖活性均有抑制作用，在THSG濃度低于50 mmol/L時，細胞增殖抑制率低于50%，并且沒有發現明顯的萎縮等生長不良現象，因此，后續實驗采用10、20、40 mmol/L的THSG處理細胞。CCK8實驗結果發現，THSG呈時間和濃度依賴的方式抑制SW116細胞增殖；流式細胞儀分析SW116細胞的凋亡率發現，THSG處理SW116細胞后，大腸癌細胞的凋亡率均有不同程度的增加。PARP和caspase 3蛋白表達調控著細胞凋亡過程，在腫瘤細胞凋亡發生過程PARP的切割顯著增強，而Pro-caspase 3的表達亦因切割而明顯降低[14-15]。本實驗結果也發現，THSG能顯著誘導PARP切割，抑制Pro-caspase-3蛋白表達，促使SW116細胞凋亡發生。

ERK、JNK和p38 MAPK屬于MAPKs家族的3個成員，介導著腫瘤細胞的增殖、凋亡及遷移等多個生物過程[5-6]。有關報道證實JNK和p38 信號通路激活能夠導致細胞凋亡[16]，然而ERK信號傳導活化可以誘導細胞增殖及分化，屬于細胞存活的正向調節子[17]。然而，已有研究提出，THSG能夠通過調節MAPKs信號通路抑制腫瘤細胞增殖[10]。使用p38、JNK和ERK的特異性抑制劑SB203580、SP600125和U0126抑制MAPKs信號通路活化，也可以證實p38、JNK和ERK信號傳導途徑參與腫瘤細胞凋亡過程。本研究發現，THSG干預SW116細胞后，細胞中ERK的磷酸化水平顯著降低，而p38和JNK的磷酸化水平顯著升高，而且ERK、p38和JNK磷酸化水平變化與THSG的用藥劑量呈正相關。為了進一步證實MAPKs信號通路確實介導了THSG誘導大腸癌細胞的凋亡，本實驗采用p38、JNK和ERK特異性抑制劑阻斷MAPKs信號傳導，流式細胞儀觀察SW116細胞凋亡情況。結果發現，阻斷p38、JNK磷酸化可以部分逆轉THSG誘導大腸癌細胞凋亡；ERK特異性抑制劑能增強THSG誘導大腸癌細胞的凋亡。總之，THSG通過激活p38和JNK信號傳導，抑制ERK信號途徑，誘導大腸癌SW116細胞凋亡。