HPLC法快速測(cè)定保健食品中化學(xué)藥物添加的研究

金鑫，朱志英

（烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

隨著肥胖癥發(fā)病率逐年升高，現(xiàn)已成為危害人類健康的嚴(yán)重問(wèn)題，減肥已成為現(xiàn)代人的潮流，而通過(guò)減肥保健品進(jìn)行減肥是大多數(shù)肥胖或亞肥胖人群減肥方法的首選，減肥保健品的需求逐年增大。部分生產(chǎn)商為了突顯保健品的減肥效果，非法添加鹽酸芬氟拉明、西布曲明、氟苯丙胺等化學(xué)藥物[1-3]，這些化學(xué)藥物可通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)活性抑制食欲、提高基礎(chǔ)代謝率或阻斷食物吸收等途徑達(dá)到減肥目的，但也可引起焦慮、興奮、便秘、失眠、心悸、食欲不振、心血管疾病，且對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)和心臟瓣膜易造成損傷，已被許多國(guó)家禁止生產(chǎn)和使用[4-6]。為保障消費(fèi)者健康，促進(jìn)減肥保健品產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，建立簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定減肥保健品中非法添加化學(xué)藥物的方法非常必要。

目前對(duì)于減肥保健品中非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)方法包括電化學(xué)分析法[7]、光譜法[8]、薄層色譜法[9]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[13-17]等，其中電化學(xué)分析法、光譜法和薄層色譜法可同時(shí)檢測(cè)藥物種類不多；HPLC 法具有高效、簡(jiǎn)便、適用于大批量樣品中多種藥物的快速檢測(cè)；LC-MS/MS 法具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)和準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，但由于質(zhì)譜儀價(jià)格相對(duì)昂貴、操作復(fù)雜、分析成本高，難以實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速檢測(cè)。本文選擇減肥保健食品中12種可能非法添加化學(xué)藥物（苯丙醇胺、麻黃堿、偽麻黃堿、咖啡因、芬氟拉明、普伐他汀、呋塞米、N，N-雙去甲基西布曲明、氟西汀、酚酞、N-單去甲基西布曲明、西布曲明）為研究對(duì)象，采用酸化甲醇超聲萃取、固相萃取柱Oasis MCX 凈化，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定，建立HPLC 法測(cè)定減肥保健食品中12 種非法添加化學(xué)藥物的含量，并采用LC-MS/MS 法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證，避免檢測(cè)假陽(yáng)性，以期為減肥保健食品中非法添加化學(xué)藥物大批量快速檢測(cè)提供簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的分析技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 種減肥保健食品（膠囊、口服液、片劑、沖劑等形態(tài)），均購(gòu)自蘇寧易購(gòu)網(wǎng)上商城。

甲醇、乙腈、甲酸、丙酮，均為色譜純：美國(guó)Tedia公司；鹽酸、冰乙酸、氨水，均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為超純水；12 種化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：苯丙醇胺、麻黃堿、偽麻黃堿、咖啡因、芬氟拉明、普伐他汀、呋塞米、N，N-雙去甲基西布曲明、氟西汀、酚酞、N-單去甲基西布曲明、西布曲明：純度均≥95.0%，中國(guó)藥品生物制品檢定所。12 種化學(xué)藥物相關(guān)信息見表1。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695 型高效液相色譜儀、Waters Xevo TQD型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters 公司；TP-114 型電子天平：美國(guó)Sartorious 公司；JP-060 型超聲波清洗機(jī)：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；Vortex-Genie2 型渦旋混合儀：美國(guó) Scientific Industries 公司；Milli-Q 型超純水器：美國(guó)Millipore 公司；Autotrace SPE 型全自動(dòng)固相萃取儀：美國(guó)Caliper 公司；TTL-DC 型氮吹儀：北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速為 0.2 mL/min；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相 B：20 mmol/L 乙酸銨溶液（含0.1%冰乙酸）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210、225、265 nm；流動(dòng)相梯度洗脫條件：梯度洗脫程序：0～5.0 min，30%～60%A；5.0 min～14.0 min，60%～90%A；14.0 min～16.0 min，90%～30%A；16.0 min～18.0 min，30%A。

表1 12 種化學(xué)藥物相關(guān)信息Table 1 Information of 12 kinds of chemistry medicine

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），ESI+模式和ESI-模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiplereactionmonitoring，MRM）；離子源溫度：450 ℃。ESI+模式時(shí)：毛細(xì)管電壓為4.0 kV，脫溶劑氣溫度為300 ℃，去溶劑氣流量為600 L/h，錐孔氣流速為55 L/h；ESI-模式時(shí)：毛細(xì)管電壓為3.5 kV，脫溶劑氣溫度為350 ℃，去溶劑氣流量為700 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。12 種化學(xué)藥物的其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.3.3 樣品前處理

取樣品2.0 g（精度至0.1 mg）置于50 mL 離心管中，加入15 mL 甲醇（含0.1%甲酸），渦旋混合后超聲（900 W，40 kHz）提取 20 min，以 10 000 r/min 離心5 min，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至3 mL，經(jīng)Oasis MCX 固相萃取柱（使用前依次用丙酮、甲醇、水各3 mL 活化）凈化，依次用0.1 mol/L 鹽酸3 mL、30%甲醇（含2%氨水）3 mL 淋洗，再用6 mL 甲醇-水-氨水（體積比為80 ∶12 ∶8）洗脫，洗脫液氮?dú)獯蹈桑?1 mL 流動(dòng)相溶解殘?jiān)筮^(guò)0.22 μm 濾膜后備用。

表2 12 種化學(xué)藥物質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of 12 kinds of illegally adulterated chemical drugs

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取12 種化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用甲醇溶解，制成濃度為1 000 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；用甲醇逐級(jí)稀釋500 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依次配置質(zhì)量濃度為50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)6 次，結(jié)果表示為平均值，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 軟件分析；采用Origin 7.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)190 nm～800 nm 范圍內(nèi)對(duì)12 種減肥保健食品中可能非法添加化學(xué)藥物進(jìn)行紫外光譜吸收峰掃描，經(jīng)優(yōu)化后結(jié)果顯示：苯丙醇胺、麻黃堿、偽麻黃堿的檢測(cè)波長(zhǎng)選擇210 nm，咖啡因、N，N-雙去甲基西布曲明、氟西汀、酚酞、N-單去甲基西布曲明、西布曲明的檢測(cè)波長(zhǎng)選擇225 nm；芬氟拉明、普伐他汀、呋塞米的檢測(cè)波長(zhǎng)選擇265 nm。

2.2 色譜柱的選擇

選擇合適的色譜柱是液相色譜分析的關(guān)鍵，考察了 Waters XTerra C18、Diamonsil C18、Waters Atlantis T3 C18、Penomenex C18、Inertsil C18、Waters CORTECS C18、Symmetry C18等不同C18柱對(duì)12 種減肥保健食品中可能非法添加化學(xué)藥物的分離效果。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 12 種可能非法添加化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of 12 kinds of illegally adulterated chemical drugs

由圖1 可知：Waters Atlantis T3 C18色譜柱對(duì) 12 種減肥保健食品中可能非法添加化學(xué)藥物具有良好的保留、分離能力（圖1），這可能是由于目標(biāo)物與Atlantis T3 C18色譜柱固定相上的硅羥基之間的相互作用所致。因此分析用色譜柱選擇Waters XTerra C18。

2.3 流動(dòng)相的選擇

以Waters Atlantis T3 C18為分析柱，以甲醇/乙腈為有機(jī)相、以不同濃度的乙酸銨溶液/磷酸溶液為水相，分別考察不同流動(dòng)相體系對(duì)減肥保健食品中12 種可能非法添加化學(xué)藥物的色譜分離行為的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)采用甲醇/乙腈-水/磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，部分目標(biāo)物色譜峰分離度和峰形較差；當(dāng)采用甲醇-20 mmol/L 乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，經(jīng)逐步優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫程序，12 種化學(xué)藥物可實(shí)現(xiàn)分離，尤其是乙酸銨溶液中加入0.1%冰乙酸，色譜峰峰型更為符合正態(tài)分布，保留時(shí)間適中，基線平穩(wěn)且分離效果良好，因此流動(dòng)相選擇甲醇-20 mmol/L 乙酸銨溶液（含0.1%冰乙酸）。

2.4 提取溶劑的選擇

由于12 種化學(xué)藥物大部分溶解于甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷和酸性水溶液中，故考察甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷和酸性水溶液對(duì)減肥保健食品中12 種可能非法添加化學(xué)藥物的提取效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示：采用甲醇作為提取溶劑時(shí)，大部分化學(xué)藥物的提取回收率較高（＞90%），但為提高弱極性的西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明提取效率，在甲醇中加入0.1%甲酸，可提高12 種化學(xué)藥物的提取回收率（平均值為96.4%），且有利于各目標(biāo)物充分解離成帶電荷基團(tuán)，以便后續(xù)與固相萃取柱鍵合硅膠上的帶電基團(tuán)互相吸附。因此提取溶劑選擇甲醇（含0.1%甲酸）。

2.5 凈化柱的選擇

考察了弱陽(yáng)離子（weak cation exchanger，WCX）、弱陰離子（weak anion exchanger，WAX）、混合型陽(yáng)離子（mixed-mode cation exchanger，MCX）、混合型陰離子（mixed-mode anion exchanger，MAX）、親水-親酯（hydrophilic-lipophilic balance，HLB）、硅膠（silica，SIL）等不同極性固相萃取柱對(duì)12 種減肥保健食品中可能非法添加化學(xué)藥物的凈化回收效果。固相萃取柱對(duì)12 種可能非法添加化學(xué)藥物的平均凈化回收率見圖2。

圖2 固相萃取柱對(duì)12 種可能非法添加化學(xué)藥物的平均凈化回收率Fig.2 Average extraction rate of 12 kinds of illegally adulterated chemical drugs by solid phase extraction column

由圖2 可知：根據(jù)不同固相萃取柱對(duì)12 種化學(xué)藥物平均凈化回收率大小排序：MCX（97.2 %）＞W(wǎng)CX（91.6%）＞MAX（87.4%）＞W(wǎng)AX（84.1%）＞HLB（83.6%）＞ SIL（80.3%），其中 MCX 對(duì) 12 種化學(xué)藥物的平均凈化回收率在94.3%～102.7%，凈化回收效果最好，這可能是由于MCX 屬于混合型陽(yáng)離子固相萃取柱，具有強(qiáng)陽(yáng)離子交換和反向保留作用的混合型吸附劑，經(jīng)0.1 mol/L 鹽酸淋洗可有效洗脫樣品中中性或酸性雜質(zhì)，經(jīng)30%甲醇（含2%氨水）可洗脫樣品中部分堿性干擾雜質(zhì)。因此凈化柱選擇MCX 柱。

2.6 質(zhì)譜確證條件的優(yōu)化

由于減肥保健食品基質(zhì)較為復(fù)雜，采用HPLC 法測(cè)定減肥保健食品中12 種可能非法添加化學(xué)藥物時(shí)容易造成假陽(yáng)性和假陰性；為驗(yàn)證HPLC 法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文采用LC-MS/MS 法對(duì)篩選出的非法添加化學(xué)藥物的陽(yáng)性樣品進(jìn)行質(zhì)譜確證。12 種可能非法添加化學(xué)藥物的MRM 總離子流圖見圖3。

圖3 12 種可能非法添加化學(xué)藥物的MRM 總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of 12 kinds of illegally adulterated chemical drugs

由圖3 可知：普伐他汀、呋塞米在離子源ESI-電離方式下形成的[M-H]-準(zhǔn)分子離子響應(yīng)信號(hào)較強(qiáng)，其余10 種化學(xué)藥物在ESI+電離方式下形成的[M+H]+準(zhǔn)分子離子響應(yīng)信號(hào)較強(qiáng)；采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，經(jīng)優(yōu)化碰撞能量和錐孔電壓，使各目標(biāo)物離子化效率達(dá)到最佳，均獲得響應(yīng)信號(hào)穩(wěn)定的碎片離子。

2.7 線性范圍和檢出限

用甲醇依次配制質(zhì)量濃度為 50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按本文所建HPLC 法對(duì)12 種可能非法添加化學(xué)藥物進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至信噪比S/N=10 為方法定量限（limit of quantity，LOQ），以信噪比 S/N=3 為方法檢出限（limite of detection，LOD），線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限等參數(shù)見表3。

由表3 可知：12 種可能非法添加化學(xué)藥物在1.0 μg/mL～50.0 μg/mL 范圍內(nèi)，12 種可能非法添加化學(xué)藥物質(zhì)量濃度（x）與其色譜峰面積（y）呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5；LOQ 在0.25 mg/kg～1.0 mg/kg，LOD 在 0.08 mg/kg～0.30 mg/kg。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficients，detection limit and limit of quantitation

2.8 回收率和精密度

根據(jù)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》附錄F 中檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求，在3份不含目標(biāo)物的減肥保健食品中添加12 種化學(xué)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/kg（方法測(cè)定低限）、2.0 mg/kg（兩倍方法測(cè)定低限）、10.0 mg/kg（十倍方法測(cè)定低限），每個(gè)濃度做6 次平行，按本文所建HPLC 法測(cè)定回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表4。

表4 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recovery and relative standard deviation（n=6）

由表4 可知：在 1.0 mg/kg～10.0 mg/kg 加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，12 種可能非法添加化學(xué)藥物的回收率在88.6%～102.6%，RSD 在 1.2%～3.6%，其結(jié)果符合 GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的相關(guān)要求。

2.9 實(shí)際樣品的測(cè)定

針對(duì)隨機(jī)選購(gòu)的10 份減肥保健食品，其中膠囊2份、口服液2 份、片劑3 份、沖劑3 份，按本文所建HPLC 法快速篩查減肥保健食品中12 種可能非法添加化學(xué)藥物的含量；采用LC-MS/MS 法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行質(zhì)譜確證，避免假陽(yáng)性。結(jié)果顯示：10 份受檢的樣品，1 份樣品檢出含有N，N-雙去甲基西布曲明，檢出量為37.2 mg/kg。這表明部分減肥保健食品生產(chǎn)商為了增強(qiáng)產(chǎn)品減肥效果和逃避監(jiān)管部門的行政監(jiān)督，非法添加與西布曲明具有同樣減肥活性的N，N-雙去甲基西布曲明。為保護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益和身體健康，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)減肥保健食品中可能非法添加化學(xué)藥物風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。

3 結(jié)論

本文以12 種減肥保健食品中可能非法添加的化學(xué)藥物為研究對(duì)象，采用酸化甲醇超聲萃取、固相萃取柱Oasis MCX 凈化，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定，建立了HPLC 法測(cè)定減肥保健食品中12 種非法添加化學(xué)藥物的含量，并采用LC-MS/MS 法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證。研究結(jié)果顯示：在 1.0 μg/mL～50.0 μg/mL 范圍內(nèi)，12 種可能非法添加化學(xué)藥物質(zhì)量濃度與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5；LOQ 在 0.25 mg/kg ～1.0 mg/kg，LOD 在 0.08 mg/kg ～0.30 mg/kg；回收率在88.6%～102.6%，RSD 在1.2%～3.6%。本文所建HPLC 法簡(jiǎn)便高效、回收率高、精密度好，可為減肥保健食品中非法添加化學(xué)藥物大批量快速檢測(cè)提供簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的分析技術(shù)。