傳統東北酸菜中乳桿菌的分離鑒定及其降膽固醇特性研究

馬長路，焦夢麗，羅紅霞，逄曉陽，蘆晶，張書文，呂加平，*，妥彥峰

（1.北京農業職業學院食品與生物工程系，北京102442；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京100193；3.北京農學院食品科學與工程學院，北京102206；4.大連工業大學食品學院，遼寧大連116034）

半個世紀以來，心腦血管疾病已成為威脅人類健康的首要疾病，其死亡率已超過所有癌癥的總和。流行病學和臨床調查表明，高膽固醇是引發該疾病的重要因素之一，降低血清膽固醇水平，特別是低密度脂蛋白水平，能顯著降低該疾病的發病率和死亡率[1-3]。某些乳酸菌菌株，能夠促進胃腸道吸收，增加腸道有益菌群，改善人體胃腸道功能，抑制腐敗菌的繁殖，提高機體免疫力等重要生理功能[4]。國內外有研究表明：部分乳酸菌具有較強的降膽固醇能力，長期食用含乳酸菌的食品或乳酸菌發酵食品可有效降低人體血液中的膽固醇質量分數，從而大大減少心血管疾病的發生[5]。酸菜作為我國東北地區的一種傳統乳酸菌蔬菜發酵制品，其以營養豐富、酸鮮脆嫩、解膩開胃等特點深受廣大群眾的喜愛，且研究表明酸菜汁液中富含大量乳酸菌[6]。本試驗選用MRS 培養基從東北農家自然發酵的酸菜中分離乳酸菌，通過體外試驗研究其功能特性，篩選出具有耐酸耐膽鹽、降膽固醇能力的菌株，并進行菌種鑒定，豐富降膽固醇乳酸菌菌種資源庫，也為后續試驗提供材料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

酸菜汁液：采自黑龍江佳木斯市農家發酵酸菜，采集樣品于離心管內，加入無菌甘油使終濃度為25%，于-80 ℃冰箱保存。

MRS 培養基：北京陸橋技術股份有限公司；MRSCHOL 培養基[7]：膽固醇 1.0 g，加 1 mL 吐溫-80 助溶，加入1 000 mL MRS 液體培養基中，調pH 值至7.0。

革蘭氏染色試劑盒、乳酸菌生化鑒定試劑盒：北京陸橋技術股份有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、引物、TE 緩沖液、DNA Marker、ddH2O、Mix 液：天根生化科技有限公司；牛膽鹽、膽固醇（99 %）：美國sigma 公司；鄰苯二甲醛、氯化鈉、鹽酸、冰乙酸、正己烷、無水乙醇、氫氧化鉀等試劑均為分析純級：國藥化學試劑集團。

1.2 主要設備及儀器

DHP-9082 恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；HDL 超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；GL124-1SCN 萬分之一分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅火器：上海申安醫療器械廠；PHS-3C 雷磁pH 計：上海精密科學儀器有限公司；SHB-III 循環水式多用真空泵：上海振捷實驗設備有限公司；CX41RF 顯微鏡：日本奧林巴斯公司；TP600 梯度 PCR 儀：日本 TAKARA 公司；Sigma-3K15 離心機：德國SIGMA 科技有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計：島津儀器有限公司；DYY-6C 電泳儀：北六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的初步分離純化

將帶回的酸菜汁液解凍，以備使用。采用梯度平板稀釋法，吸取酸菜汁液于0.85%理鹽水中進行梯度稀釋，然后涂布于含0.5%CaCO3的固體MRS 培養基上，37 ℃靜置培養48 h，挑選平板上有明顯透明圈的菌落，在MRS 平板上多次劃線純化直至菌落形態單一，挑取單菌落到MRS 液體培養基增菌培養24 h，記錄菌落特征，于4 ℃冰箱存儲備用[8-10]。

1.3.2 生理生化鑒定試驗

對菌株進行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗、采用乳酸菌生化鑒定試劑盒做碳水化合物（蔗糖、甘露醇、山梨醇、水楊苷等）發酵試驗[5]。

1.3.3 菌種16S rDNA 鑒定試驗[5]

采用細菌基因組DNA 試劑盒提取細菌DNA，利用引 物 27F （5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 進行擴增；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應程序為：95 ℃預變性 4 min；95 ℃變性 45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，循環 30 次；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 產物經1%瓊脂糖電泳分析后，送交華大基因公司進行16S rDNA 測序，所得序列在NCBI 中進行比對，確定菌種。

1.3.4 降膽固醇乳酸菌的篩選

繪制膽固醇標準曲線：取1 mL 的配制質量濃度為0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/mL 的膽固醇系列標準溶液，加入3 mL 95%乙醇、2 mL 50%氫氧化鉀，旋渦振蕩混勻。于60 ℃下恒溫水浴10 min，冷卻后加入5 mL 正己烷，旋渦振蕩萃取1 min～2 min，加入2 mL蒸餾水，振蕩均勻，靜置分層。吸取2 mL 上層正己烷，60 ℃水浴氮氣吹干，加入4 mL 0.5 mg/mL 鄰苯二甲醛溶液和2 mL 濃硫酸，顯色反應20 min，測定吸光值（A550）并繪制膽固醇標準曲線[11]；

乳酸菌降解膽固醇能力測定：將培養好的乳酸菌菌液，按5%接種量接種于10 mL 降膽固醇篩選培養基（MRS-CHOL 培養基）中，取1mL 上清液測膽固醇含量作為空白；再于37 ℃靜置培養48 h，搖勻后立即取樣1 mL，12 000×g 離心5 min，用鄰苯二甲醛比色法測定上清中膽固醇含量[12]。平行試驗3 次取平均值。

式中：A 為受試菌株在MRS-CHOL 培養基中37 ℃靜置培養 48 h 后膽固醇殘留量，mg/mL；C 為空白MRS-CHOL 培養基中膽固醇含量，mg/mL。

1.3.5 耐酸耐膽鹽試驗[2，13-15]

將接種于MRS 液體培養基的乳酸菌按2%接種量接種于 pH=3.0、pH=4.0、pH=5.0 液體 MRS 培養基中，37 ℃培養 24 h，以 pH=6.0 的 MRS 培養基為空白對照，測各組菌液的OD600nm值，重復3 次取平均值。

式中：N 為菌株在不同pH 值培養液中培養24 h后的OD 值；N0為菌株在pH=6.0 培養液中培養24 h后的OD 值。

配制膽鹽濃度為1、2、3 g/L 的液體MRS 培養基，將乳桿菌液按2%接種量接種于不同膽鹽濃度MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，以不加膽鹽的MRS 培養基為空白對照，測各組菌液的OD600nm值；

式中：A 為測試菌株在不同膽鹽濃度培養液中培養24 h 后菌液的OD 值；A0為菌株在不含膽鹽培養液中培養24 h 后菌液的OD 值。

1.3.6 統計分析

采用Excel、SPSS19.0 軟件分析處理數據。

2 結果分析

2.1 酸菜中乳酸菌分離及鑒定結果

對100 個酸菜樣本中乳酸菌進行分離培養，最終成功分離鑒定10 株菌，并對此10 株菌定義編號為M：姓氏馬+H：黑龍江縮寫黑+S：酸菜+年限+編號；即 MHS1701、MHS1702、MHS1703、MHS1704、MHS1705、MHS1706、MHS1707、MHS1708、MHS1709、MHS1710。經培養，10 株菌菌落呈中等大小，有凸起，乳白色，濕潤，明顯溶鈣圈，邊緣整齊，菌落呈圓形，且挑取時具有黏性。

10 株菌革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶反應呈陰性，并對其碳水化合物利用特性進行測定，結果如表1所示。

表1 乳酸菌分離菌株菌落特征Table 1 Colony characteristics of lactic acid bacteria isolates

MHS1704 不發酵山梨醇，MHS1710 不水解蔗糖。根據查閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》，乳桿菌屬細菌可利用的碳源有葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、糊精、七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖等，結合試驗結果分析，初步判斷10 株菌均為乳酸桿菌屬。

采用細菌DNA 基因組試劑盒提取10 株菌株基因組DNA，產物通過PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最終檢測電泳圖有且只有一個條帶，標準Marker條帶為2 000 bp，各菌株條帶在1 000 bp 左右。菌株DNA 提取產物條帶單一，且與預期目的大小一致，可以滿足后續測序要求。

利用 BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將所測定的10 株菌株的16S rDNA 序列，與GenBank/EMBL/DDBJ 數據庫對比[7]，具體鑒定結果如表2 所示。

表2 16S rDNA 序列對比結果Table 2 Comparison of 16s rDNA sequences

酸菜中微生物多樣性大多采用傳統培養的方法進行篩選分離、鑒定。目前，李欣等[4]采自大慶地區的傳統酸菜發酵液中分離得到14 株菌株，其中4 株彎曲乳桿菌、3 株清酒乳桿菌、5 株植物乳桿菌、1 株短乳桿菌和1 株腸膜明串珠菌。栗永樂等[6]從內蒙古東部地區采集的14 份農家酸菜汁中分離出84 株乳酸菌，分別鑒定為植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、短乳桿菌和耐酸乳桿菌、唾液鏈球菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、植物乳球菌、腸膜明串株菌。奎夢漪等[16]從云南自然發酵酸菜液中的優勢乳酸菌分離出12 株乳酸菌，分別為植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌。本研究從傳統東北農家酸菜中分離得到10 株菌，經16S r DNA 序列分析鑒定為植物乳桿菌、棒狀乳桿菌、干酪乳桿菌和短乳桿菌。傳統發酵酸菜是一個豐富的乳酸菌資源庫，并且酸菜具有悠久的安全食用史，因此可以從中篩選具有潛在益生功能的乳酸菌菌株。

2.2 乳酸菌降膽固醇結果

采用鄰苯二甲醛法獲得膽固醇標準曲及回歸方程為y=2.487 5x-0.024 7，R2=0.997 8，呈現良好的線性關系。

通過鄰苯二甲醛法測定10 株乳桿菌的膽固醇去除情況，結果如表3 所示。

10 株乳桿菌都具有一定的降解膽固醇的能力，膽固醇脫除率從9%～60%不等，不同菌株間膽固醇脫除率差異較大，與黃燕燕等[2]研究結果類似。其中菌株MHS1701、MHS1703、MHS1706 的膽固醇脫除率超過40%以上，分別為40.71%、52.84%、41.41%，菌株MHS1701、MHS1706 較汪曉輝等[12]的研究結果偏低，可能與酸菜樣本、乳酸菌個體差異、培養條件等因素有關。初篩結果選取 MHS1701、MHS1703、MHS1706 3 株脫除率高的菌株。

表3 乳酸菌去除膽固醇試驗結果（n=3）Table 3 Results of cholesterol removal test by lactic acid bacteria（n=3）

2.3 乳酸菌在低pH值及高膽鹽條件下的存活性

10 株不同乳桿菌在不同pH 值培養液及含不同膽鹽培養液中的生長狀況如表4、表5 所示。

表4 MHS1701～MHS1710 的耐酸性（n=3）Table 4 Acid tolerance of MHS1701-MHS1710（n=3） %

為保證乳酸菌在胃腸道內具有良好的存活能力，必須有耐胃酸耐膽鹽的特性。結合表4、表5 耐酸耐膽鹽結果可知，10 株乳酸菌MHS1701～MHS1710 在不同pH 值和不同膽鹽濃度下的耐受能力相差不大。10 株乳酸菌耐酸性隨著pH 值降低而降低，在pH=3 下各菌株的耐酸能力較小；隨著膽鹽濃度上升，各菌株的耐膽鹽能力有小幅度下降，此結果與林龍鎮等[15]經不同培養條件下平板計活菌數的結果一致。其中篩選得到的降膽固醇能力較好的3 株目標菌株MHS1701、MHS1703、MHS1706 中 MHS1701 在 pH=3 下的耐酸性最強，為2.03 %；目標菌株中MHS1701 耐膽鹽效果最好，達11.95 %。因此，菌株MHS1701 具有優良功能特性。

表5 MHS1701～MHS1710 的膽鹽耐受性（n=3）Table 5 Gallbladder salt tolerance of MHS1701-MHS1710（n=3）%

3 結論

本試驗從傳統東北發酵酸菜中分離獲得植物乳桿菌、棒狀乳桿菌、干酪乳桿菌及短乳桿菌共10 株菌；要求篩選出的乳酸菌除了具備特定的降膽固醇功能以外，還必須具有益生菌所共有的優良特性，試驗表明各菌株在pH 值為3.0 的環境以及3 g/L 的膽鹽濃度下具有一定的耐受性；各菌株膽固醇脫除率在9%～60%之間，MHS1701、MHS1703、MHS1706 菌株的膽固醇清除能力分別達41%、53%、41%，且MHS1701 的耐酸耐膽鹽能力最強。因此傳統東北酸菜可以作為降解膽固醇乳酸菌的來源庫，通過體外培養篩選得到的植物乳桿菌MHS1701 的功能特性最明顯，有實際應用價值。