補髓生血顆粒對慢性再生障礙性貧血患者骨髓VLA-4和VLA-5mRNA表達的影響

王金環， 李鶴然， 郝晶， 欒仲秋， 孫鳳， 趙偉，王小東， 田飛， 孫岸弢， 孫偉正

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040；3.中國中醫科學院廣安門醫院，北京100700）

慢性再生障礙性貧血（chronic aplastic anemia，CAA），屬于原發性骨髓造血衰竭性貧血的一種，其主要表現是紅髓衰竭和骨髓小粒空虛，以貧血、出血、感染為主要臨床表現[1]。中醫將其稱為“髓勞病”，病位在骨髓。其病機為“腎虛髓枯為本，脾虛氣血不足為標”，治療則以補益為原則，以補腎填精為基本大法。我們在前期研究的基礎上，進一步探討補腎生血中藥治療CAA的療效機理和作用機制，觀察補髓生血顆粒對CAA患者骨髓極遲活化抗原4（very late antigen-4，VLA-4）和極遲活化抗原5（very lateantigen-5，VLA-5）mRNA表達的影響，現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年11月至2016年10月期間黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院血液病科門診及住院部所收集的30例CAA腎陰陽兩虛型患者為試驗組，其中男18例，女12例。另招募10例無血液疾病及免疫系統疾病的健康志愿者為正常對照組。

1.2 診斷標準 參照張之南主編的第3版《血液病診斷及療效標準》[2]中CAA的診斷標準和《中藥新藥臨床研究指導原則》[3]中慢性髓勞病的中醫證候診斷標準，中醫證型為腎陰陽兩虛型。

1.3 納入標準 ①符合CAA的西醫診斷標準和慢性髓勞病的中醫證候診斷標準，中醫證型為腎陰陽兩虛型；②發病后未經西醫治療或經過治療6個月以上無效者；③年齡大于22歲且小于56歲；④同意參加本研究，簽署知情同意書，并有良好依從性的患者。

1.4 排除標準 ①妊娠期及哺乳期婦女；②患有引起全血細胞減少的其他疾病患者；③對試驗藥物成分過敏的患者；④精神性疾病患者；⑤合并有嚴重心、腦、肝、腎疾病患者；⑥依從性差，未按規定服藥，療程不足6個月的患者。

1.5 治療方法 試驗組患者給予補髓生血顆粒治療。用法：入選患者均于入組前2周停服其他治療CAA的藥物，2周后開始服用補髓生血顆粒（為黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院院內制劑，主要由人參、熟地黃、鹿茸、白花蛇舌草、山茱萸、巴戟天、豬苓、淫羊藿等藥物組成），每日3次，每次1袋，連續服用6個月。

1.6 觀察指標及測定方法 應用實時熒光定量逆轉錄—聚合酶鏈反應（PT-PCR）法檢測CAA患者治療前后骨髓VLA-4和VLA-5mRNA表達水平的變化情況。

1.7 統計方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據的統計分析處理。計量資料數據采用均數±標準差（）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內治療前后比較釆用配對樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 試驗組患者治療前后骨髓VLA-4mRNA表達水平比較 表1和圖1結果顯示：治療前，試驗組患者骨髓VLA-4mRNA表達水平明顯低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療后，試驗組患者VLA-4mRNA表達水平較治療前有一定程度升高，差異有統計學意義（P＜0.05），但仍未恢復到正常對照組水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 試驗組患者治療前后骨髓VLA-4m RNA表達水平比較Table 1 Com parison of VLA-4m RNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

表1 試驗組患者治療前后骨髓VLA-4m RNA表達水平比較Table 1 Com parison of VLA-4m RNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

①P＜0.05，與正常對照組比較；②P＜0.05，與治療前比較

組別N VLA-4mRNA治療前 治療后試驗組正常對照組30 10 23.61±1.73①45.39±1.27 38.29±2.01①②

圖1 試驗組患者治療前后骨髓VLA-4m RNA表達水平與正常對照組比較Figure 1 Comparison of VLA-4mRNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatmentw ith normalcontrolgroup

2.2 試驗組患者治療前后骨髓VLA-5mRNA表達水平比較 表2和圖2結果顯示：治療前，試驗組患者VLA-5 mRNA表達水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療后，試驗組患者VLA-5mRNA表達水平較治療前有一定程度下降，差異有統計學意義（P＜0.05），但仍未恢復到正常對照組水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 試驗組患者治療前后骨髓VLA-5m RNA表達水平比較Table 2 Comparison of VLA-5mRNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

表2 試驗組患者治療前后骨髓VLA-5m RNA表達水平比較Table 2 Comparison of VLA-5mRNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

①P＜0.05，與正常對照組比較；②P＜0.05，與治療前比較

組別N VLA-5mRNA治療前 治療后試驗組正常對照組30 10 24.85±3.24①8.02±3.20 16.32±3.19①②

圖2 試驗組患者治療前后骨髓VLA-5m RNA表達水平與正常對照組比較Figure 2 Com parison of VLA-5m RNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatmentw ith normalcontrolgroup

3 討論

補髓生血顆粒歷經50多年的臨床研究與實踐，療效確切。筆者在過去的臨床實踐中，通過觀察205例慢性再生障礙性貧血（CAA）患者，發現補髓生血顆粒治療陰虛型CAA患者的有效率為68.00%，治療陽虛患者的有效率為89.25%[4]；張守琳等[5]對32例CAA患者進行臨床觀察，應用補髓生血顆粒治療后的總有效率為75.0%；李志俠[6]對30例CAA患者的臨床研究發現，補髓生血顆粒治療CAA的總有效率為79.99%；劉娜等[7]對67例CAA患者展開研究，發現補髓生血顆粒治療CAA療效較好，能明顯改善患者不適癥狀，提高中醫證候平均積分，改善骨髓增生程度，提高患者的血紅蛋白及白細胞計數水平，以上研究結果均提示了補髓生血顆粒治療CAA的療效顯著。

骨髓為血液的主要制造場所。中醫學認為，人始生，先成精，精成而腦髓生，骨為干，脈為營，血乃成。髓勞病的發病主要是腎精虧虛，腎陰虧損，陰損及陽，腎陽不振，則骨髓無力造血，陰不制陽，虛熱內生，熬精耗液，陰損更甚，日久則精竭髓枯，如此往復，惡性循環。補髓生血顆粒對CAA的治療主要是通過補腎生血的方法來達到治療目的。該藥根據中醫腎藏精、精生髓、精血同源的理論，采用補腎填精益髓之法，滋陰壯陽，補腎填精[8]。方中應用熟地黃、山茱萸、枸杞子等滋陰補腎養血；淫羊藿、巴戟天等補腎益氣壯陽，黃芪、人參大補元氣、生精化血，丹參、雞血藤等活血化瘀、去瘀生新，白花蛇舌草、豬苓清熱解毒。在應用補髓生血顆粒治療CAA的過程中，我們發現補腎生血中藥可以通過調節細胞的黏附分子，進而調節造血微環境，促進骨髓造血功能的重塑。

整合素是細胞表面糖蛋白受體的主要家族[9]，是細胞識別的重要途徑。整合素在體內表達廣泛，在生命活動中扮演著至關重要的角色，它能夠介導細胞和細胞外基質的黏附情況，還能夠誘導各細胞間的相互作用。其中成員最多的為β1整合素，VLA-4和VLA-5則是β1整合素家族中激活晚期出現的VLA亞家族成員。VLA-4一般表達于各種淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞的表面，能夠穿過相應配體到達炎癥部位，在淋巴細胞的解析、生存、遷移、分化、歸巢等多種細胞生命活動中起到較為關鍵的作用[10]。VLA-5能夠參與細胞與細胞外基質的黏附作用，促進造血細胞的分化和生長。

CAA患者發病時VLA-4呈低表達狀態，說明VLA-4可能參與了CAA的造血微環境的發病機制[11]。VLA-4與調節造血干/祖細胞和骨髓基質細胞之間的黏附作用有關。有研究[12]顯示，黏附分子VLA-4能夠結合多種配體，既能介導細胞間的相互作用，又能介導細胞內外的黏附信息，是介導造血干細胞與骨髓黏附能力較為重要的受體。纖維連接蛋白（FN）是骨髓基質的主要組成成分，與VLA-4相結合可以介導骨髓干細胞與骨髓微環境的黏附作用，使干細胞固定于骨髓中的某個位置，從而引起細胞的增殖和分化。本次研究中，治療前CAA患者骨髓黏附分子VLA-4mRNA表達低于正常對照組，經治療6個月后，患者VLA-4 mRNA表達水平上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。研究結果提示，當VLA-4mRNA呈低表達時，抑制了骨髓造血干/祖細胞的增殖和分化，可能導致CAA的發病。補髓生血顆粒通過對VLA-4mRNA黏附表達功能的調節，進而促進骨髓造血干/祖細胞的增殖和分化。

VLA-5是整合素亞家族成員之一，能夠促進造血細胞的進一步分化。用特異性抗體、細胞因子白細胞介素3（IL-3）、粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和干細胞生長因子抗體（SCF），或蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活物處理造血細胞，可增強VLA-5mRNA與其他配體結合的能力。VLA-5主要作用在細胞以及細胞外基質當中，與細胞的分化和走行息息相關。VLA-5在造血祖細胞居于骨髓過程中發揮作用，可能具有增強造血細胞生長的功能。在本次研究中，CAA患者骨髓單個核細胞黏附分子VLA-5mRNA高于正常表達，有可能參與了造血調節機制，對造血起到負調控作用，使細胞出現凋亡，從而導致CAA的發生。補髓生血顆粒通過調節VLA-5 mRNA的黏附表達功能，抑制了細胞凋亡，改善黏附功能，促進造血，改善CAA患者貧血的狀態。

杜華等[13]報道，根據VLA-4mRNA和VLA-5 mRNA對細胞外基質的影響，干細胞可迅速穿過細胞外基質遷移至骨髓腔內的干細胞龕附近，協助造血細胞黏附并定位于微環境中，促進造血干細胞和基質細胞聚合，完成造血干細胞的遷移和歸巢。在本次研究中，我們推測當VLA-4mRNA發生低表達、VLA-5mRNA發生高表達時，可能使造血干細胞的功能發生改變，導致造血細胞的黏附功能發生異常，使其歸巢能力、瞄定微環境能力下降，導致造血干細胞的增殖和分化能力降低，從而致使CAA發生。應用補髓生血顆粒，可能會平衡VLA-4mRNA和VLA-5mRNA黏附功能的表達，使低表達的VLA-4mRNA水平升高和高表達的VLA-5mRNA水平降低，雖未恢復至正常對照組水平，但對骨髓造血功能的改善則是顯而易見的。補髓生血顆粒可能通過促進造血干細胞的自我復制能力，增強細胞增殖和分化的能力，修復和改善骨髓微環境，為骨髓基質細胞的生長創造良好的生存環境。因此，應用補髓生血顆粒治療CAA，能夠刺激造血干/祖細胞的自我復制功能和增殖分化能力[14]，改善骨髓微環境的狀態，有利于促進骨髓基質細胞的生長。

綜上所述，CAA患者服用補髓生血顆粒后骨髓VLA-4mRNA、VLA-5mRNA的表達水平有比較明顯的改善，補髓生血顆粒可能通過促進β1整合素的某些黏附因子發揮其作用，從而改善造血微環境，達到促進骨髓造血干/祖細胞增殖和分化的治療目的。